Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

Voor de cross-linking, gevolgd door immunoprecipitatie. Cellen met een dichtheid van 80 tot 90% worden geïncubeerd met 1 mM ijskoud DSP in PBS, calcium, magnesium of uitsluitend DMSO.

Voertuigcontrole. DSP is een homobifunctionele, membraanpermeabele en reduceerbare crosslinker die vrije groepen binnen 12 angstroms van elkaar crosslinkt. Na de crosslinking worden de cellen gelyseerd en worden immunoprecipitaties uitgevoerd met behulp van standaardcontroles.

Proteïnecomplexen worden vervolgens gescheiden via reducerende SDS-PAGE, waarbij reducerende middelen de DSP splitsen, wat de identificatie van individuele proteïnen via immunoblot mogelijk maakt. Hallo, ik ben Stephanie Ick van het laboratorium van Dr. Victor Fonde van de afdeling Celbiologie aan de Emory University. En ik ben Pearl Ryder, ook van het Fonde-lab.

Vandaag laten we u een procedure zien voor de isolatie van eiwitcomplexen middels gecontroleerde cross-linking, gevolgd door immuno-magnetische affiniteitschromatografie. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om tijdelijke, labiele eiwitinteracties te bestuderen. Laten we beginnen.

Begin met het labelen van de onderkant van de celplaten om het celtype en de specifieke experimentele conditie aan te geven. Een plussymbool geeft hier aan dat er DSP is toegediend, inclusief een negatieve controle met alleen DMSO als vehicle. Voeg medium toe aan de platen om ze voor te bereiden op het uitplaten van de cellen.

HEK-cellen zijn uitgezaaid in een verdunning van één op vijf om de isolatie van 500 microgram eiwit per standaardbuisreactie mogelijk te maken. Een enkele buis kan voldoende zijn om de vermeende bindpartners van een eiwit van belang te identificeren via immunoblot op basis van massaspectrometrieanalyse. Verhoog het aantal standaardreacties met ten minste 10 keer.

Bereid daarnaast voorraden voor van de meeste oplossingen die in het cross-linking experiment worden gebruikt. Hieronder valt PBS aangevuld met 0,1 millimol calciumchloride en één millimol magnesiumchloride, aangeduid als PBS calcium magnesium. De toevoeging van calcium- en magnesiumionen is essentieel voor de adhesie van cellen aan de kweekplaat.

Bewaar de oplossing gedurende het experiment bij 4 °C. Andere voorraden omvatten een crosslinker-quenching-oplossing, een 50 X complete protease-inhibitorcocktail, die elke 20 minuten gevortext wordt tot het pellet is opgelost, 20% Triton X 100, dat bij 4 °C wordt bewaard en binnen één maand moet worden gebruikt, en 10 x en 1 x Buffer a-oplossingen.

Bereid en bewaar alle oplossingen zoals gedetailleerd in het bijbehorende schriftelijke protocol. Bereid tot slot de lysisbuffer bestaande uit één X buffer A plus 0,5% TRITTON X 100 en de immunomagnetische precipitatiebuffer of IP-buffer bestaande uit één X buffer.

Voeg 0,1% TRITTON X 101 toe; twee dagen na het uitplaten hebben de cellen een confluentie van 80 tot 90%, wat optimaal is voor cross-linking. Bij een hoge confluentie hebben cellen de neiging om op elkaar te stapelen, wat leidt tot een verminderde toegankelijkheid van de celpermeabele crosslinker voor alle cellen. Plaats de platen terug in de incubator tot ze klaar zijn voor de cross-linking.

Bereid de DSP-crosslinkeroplossing onmiddellijk voor voordat deze op de cellen wordt toegepast. DSP is zeer hydrofoob en wordt daarom eerst opgelost in DMSO tot een concentratie van 100 millimolar voordat het wordt verdund in de PBS calcium magnesium buffer. Om de verdunning van DSP in de PBS calcium magnesium buffer verder te bevorderen, voegt u 10 microliters van de DSP- en DMSO-stockoplossing toe aan een verwarmd en passend volume.

Voeg voor elke milliliter warme PBS calcium magnesium druppelsgewijs de D-S-P-D-M-S-O stockoplossing toe onder herhaaldelijk mengen tot alle DSP is opgelost. Bereid daarnaast een vehicle-controlesolution voor van 10 µL DMSO voor elke milliliter PBS calcium magnesium. Bewaar alle PBS calcium magnesium oplossingen na het verdunnen van de DSP maximaal 10 minuten in een ijswaterbad.

Bereid vervolgens een ijswaterbad voor waarin alle platen die in het experiment worden gebruikt passen. Haal de kweekplaten met de cellen uit de incubator van 37 °C en plaats deze onmiddellijk in het ijswaterbad. Was de cellen twee keer met ijskoude PBS calcium magnesium, waarbij dezelfde volumes worden gebruikt als eerder voorbereid voor de incubatie met de crosslinker; voor een zes-wells plaat is dit 2 mL per well, enzovoort.

Na de tweede wasbeurt wordt er ofwel de vehikelcontrole (DMSO opgelost in buffer) of de DSP-crosslinkingbufferoplossing aan de cellen toegevoegd. Incubeer dit gedurende twee uur op ijs en controleer ongeveer elke 20 minuten of alle cellen bedekt zijn door de oplossing. Als sommige cellen bloot komen te liggen, kantel en draai dan de schaal om ze opnieuw gelijkmatig te bedekken; het is normaal dat een kleine hoeveelheid DSP neerslaat.

Tijdens de incubatie van twee uur met de cellen, voordat deze periode is verstreken, dient er een 1X DSP-stopoplossing te worden bereid door de stamoplossing te verdunnen in PBS met calcium en magnesium. Bewaar de oplossing op ijs totdat deze wordt gebruikt om de cross-linking-reactie te stoppen door het niet-gereageerde DSP te inactiveren. Wanneer de twee uur zijn verstreken, worden de voertuigcontrole en de cross-linking-oplossingen van de cellen verwijderd.

Voeg de ijskoude DSP-quenchingsolutie toe en incubeer 15 minuten op ijs. Verdun ondertussen de complete protease-remmercocktail-stock 1 op 50 in de cellysebuffer. Zodra de 15 minuten voorbij zijn, worden de cellen twee keer gewassen met PBS calcium magnesium.

Voeg vervolgens de lysisbuffer met de protease-remmers toe aan de cellen en schud deze gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Gebruik na 30 minuten cellysis een celschraper om de cellen van de plaat te verzamelen. Zorg ervoor dat de lysaten op ijs worden bewaard om de protease-activiteit te minimaliseren.

Centrifugeer de cellysaten 15 minuten bij vier graden Celsius in een mini-centrifuge op het aanrecht op een topsnelheid van 15 000 Gs. Pipetteer het supernatant in een nieuwe buis en gooi het pellet weg. Analyseer de eiwitconcentraties met behulp van de Bradford-assay en ga verder met de immunoprecipitatie. Begin direct na het starten van de twee uur durende cross-linking reactie in microcentrifugebuizen met schroefdop met de voorbereidingen voor de immunoprecipitatie.

Combineer 30 µL anti-IgG immunomagnetische beads met 500 µL IP-buffer. Voeg het antilichaam tegen het doeleiwit toe. De juiste hoeveelheid antilichaam dient voor elk individueel antigeen te worden bepaald.

In voorlopige experimenten kunnen mogelijke negatieve controles voor de beads bestaan uit het weglaten van antilichamen, of beads met een isotype-controle-antilichaam om de binding van het IP-antilichaam aan de magnetische beads te controleren. Incubeer twee uur bij kamertemperatuur in een end-over-end rocker. Centrifugeer de buisjes aan het einde van de incubatie kort en plaats ze in de magnetische houder. De beads zullen zich concentreren aan de zijde van de magneet.

Verwijder de oplossing die de ongebonden antilichamen bevat en was de beads onmiddellijk om te voorkomen dat ze uitdrogen. Voeg na twee wasbeurten 500 µL van 1 µg/mL DSP-negatief of DSP-positief cellysaat toe aan de betreffende buisjes. Een negatieve controle voor peptidecompetitie kan in dit stadium worden voorbereid door het immunogene peptide in een concentratie, bepaald in voorbereidende experimenten, toe te voegen aan het mengsel van lysaat en beads.

Een andere mogelijke negatieve controle die in dit stadium kan worden voorbereid, is een reactie met alleen buffer of zonder lysaat, door enkel 500 µL lysisbuffer aan de beads toe te voegen. Resuspendeer de beads voor de experimentele reacties en de controles voorzichtig. Gebruik geen vortexer, omdat dit de beads kan beschadigen; incubeer gedurende twee uur bij vier graden met end-over-end rotatie.

Verwijder na twee uur het lysaat met behulp van de magnetische houder. Centrifugeer kort en was de beads in totaal zes keer met één milliliter IP-buffer. Laat elke wasstap vijf minuten incuberen bij vier graden Celsius.

Om de gebonden complexen te elueren, voegt u één x gel-monsterbuffer toe aan de IP-buis, net boven het kraalpellet. Tik voorzichtig tegen de bodem van de buis om de kralen naar beneden te verzamelen en ervoor te zorgen dat alle kralen opnieuw zijn gesuspendeerd in de gel-monsterbuffer. Als alternatief voegt u voor immunoaffiniteitsisolatie 30 µL buffer a, aangevuld met het immunogene peptide, toe aan de kralen.

De benodigde concentratie van het immunogene peptide wordt empirisch bepaald. Na het testen van een bereik van 10 tot 200 micromolar, worden de beads twee uur bij vier graden geïncubeerd, waarbij de buisjes elke 30 minuten kort worden aangeklopt. Gebruik de magnetische houder om de 30 microliters met de geëlueerde complexen te verwijderen en bewaar deze in een schoon buisje; was de beads met IP-buffer en bewaar deze.

Voeg één x gel-monsterbuffer toe aan de beads voor beide elutiemethoden. Verhit de immunomagnetische beads, die zijn resuspendeerd in gel-monsterbuffer, gedurende vijf minuten bij 75 °C om de eiwitten te denatureren. Deze stap zal ook het DSP-molecuul splitsen, waardoor de individuele eiwitten in het complex gescheiden kunnen worden tijdens de run.

De monsters op een SDS-PAGE-gel voor western blotting. De geleegde immunomagnetische bolletjes kunnen door centrifugatie worden afgestoten en vóór het laden met een magnetische houder uit het monster worden verwijderd. Als de immuno-affiniteit EUA vrij is van IgG, zowel via eiwitkleuring van de SDS-PAGE als via immunoblots, is deze geschikt voor massaspectrometrie.

Hier is een voorbeeld van een western blot van materiaal uit cross-linked en niet cross-linked cellysaat, gevolgd door immunomagnetische precipitatie met behulp van een monoklonaal antilichaam tegen de AP-3 subunit. Cross-linking maakt de detectie mogelijk van interagerende eiwitten die in niet cross-linked monsters tijdens immunomagnetische isolaties niet worden waargenomen. Negatieve controles vertoonden geen specifieke eiwitpull-down bij gebruik van antilichaamvrije en antilichaam-isotype-matched controles met een IgG gericht tegen de transferrinereceptor voor zowel niet cross-linked als cross-linked monsters.

In dit voorbeeld werd affiniteitpeptide-elutie gebruikt om de eiwitten te recupereren die gebonden waren aan het IP-antilichaam. Merk op dat het immuno-antilichaam afwezig is in de supernatantfractie en in de bead-fractie blijft tijdens de peptide-elutie. We hebben zojuist aangetoond hoe labiele MultiPro-complexen kunnen worden geïsoleerd met de chemische crosslinker DSP, gevolgd door immuno-magnetische affiniteitszuivering.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om celoplossingen en lysaten gekoeld te houden om labiele interacties tijdens het cross-linken te behouden en proteaseactiviteit te minimaliseren. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.