Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans

De procedure voert een dieetbeperking uit op de standaard abased-plaat in sea elegance om het effect ervan op de levensduur, reproductie en het metabolisme te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst nauwkeurig de concentratie van de bacteriën te meten die als voedselbron zullen dienen. De tweede stap van de procedure is het correct verdunnen van de bacteriecultuur tot geschikte concentraties.

Bereid vervolgens basale SDR-platen voor met gedode bacteriën. Stel tot slot SDR-experimenten op met een leeftijdgesynchroniseerde populatie wormen. De resultaten van de metingen van de nakomelingenproductie en de levensduur kunnen een vertraagde en verminderde nakomelingenproductie laten zien, evenals een verhoogde gemiddelde levensduur.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van methoden zoals Dian in AZA-medium, is dat het gehele experiment wordt uitgevoerd op een standaard vaste AGA-plaat die door de meeste laboratoria voor onderzoek naar warmte wordt gebruikt. Voor experimenten met dieetrestrictie moeten aparte kalibratiecurves worden opgesteld voor elke bacteriestam die als voedselbron wordt gebruikt. Neem een enkele kolonie e coli OP 50-bacteriën van een verse uitstrijkplaat op lb-agar en inoculeer drie milliliter vloeibare lb-bouilloncultuur in een schudincubator bij 37 °C gedurende de nacht. Bereid seriële tweevoudige verdunningen van de overnight-cultuur voor.

Meet vervolgens de absorbentie van elke verdunning bij 600 nanometer met een spectrofotometer in drievoud. Verdun elke bacteriële suspensie verder met een factor 1 miljoen; zaai vervolgens 0,4 milliliter van de bacteriële suspensie van elke verdunning gelijkmatig uit op een LB-agarplaat van 100 millimeter en incubeer deze bij 37 graden Celsius gedurende 18 tot 24 uur. Tel het aantal gegroeide bacteriële kolonies op elke plaat om de colony forming units per milliliter voor elk monster te berekenen.

Zet nu de OD 600 uit als functie van de bacteriële concentratie en voer een lineaire regressieanalyse uit om de relatie tussen de gemeten OD 600-waarden en de concentraties OP 50-bacteriën vast te stellen. Voor deze methode wordt een bacteriële concentratie van 1 × 10¹¹ CFU per milliliter gebruikt voor de ad libitum voedingsconditie en 1 × 10⁸ CFU per milliliter als optimale DR-voedingsconditie. Er kunnen echter vier tot zes verschillende bacteriële concentraties nodig zijn om een volledige dosisafhankelijke relatie vast te stellen.

Voor SDR en de bijbehorende responsen. Bereid een inoculum voor met een enkele kolonie E. coli OP 50-bacteriën in drie milliliter vloeibaar LB-bouillon, gekweekt in een schudincubator bij 37 graden Celsius gedurende zes tot acht uur. Draag de OP 50-cultuur over naar een nieuwe kolf met 500 milliliter LB-bouillon en laat deze indien nodig overnacht groeien totdat de bacteriën verzadiging bereiken.

Bereid een geschikte verdunning van de OP 50-kweek voor voor de meting van de absorptie bij OD 600. Om de bacterieconcentratie te bepalen, worden de bacteriën gepellet door centrifugatie bij 1500 Gs gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriën tot een concentratie van 1 x 10¹² CFU per milliliter.

Bereid nu bacteriële culturen van 10 milliliter voor in zes verschillende concentraties, variërend van 1 × 10¹² tot 1 × 10⁷ CFU per milliliter met een pipet. Pipetteer 0,2 milliliter van de bacteriële cultuur in het midden van een gestolde N GM-plaat van 60 millimeter. Voorkom dat de pipetpunt het oppervlak van de plaat raakt, aangezien inkepingen in het oppervlak ervoor zorgen dat wormen in de agar kunnen graven.

Plaats de platen gedurende één uur in een incubator bij 37 °C. Voeg vervolgens 10 µL 100 mg/mL carbonic soin en 10 µL 50 mg/mL can mycin aan elke plaat toe om de bacteriële groei te remmen. Bewaar de platen met verschillende concentraties antibiotica die de bacteriën hebben gedood bij 4 °C voor toekomstig gebruik, gedurende maximaal één maand.

Het is belangrijk om voldoende platen voor te bereiden en op te slaan, bij voorkeur uit dezelfde batch voor de gehele plant. Voer minimaal één tot twee dagen van tevoren een experiment uit om de levensvatbaarheid van de bacteriën te verifiëren. Schraap wat bacteriën van de SDR-platen en verspreid deze op een lege N GM-plaat met carbonic, sein en antimycine.

Plaats de plaat gedurende zes tot acht uur in een incubator van 37 °C en bevestig de afwezigheid van bacteriële groei. Voor de meeste SDR-gerelateerde studies, zoals levensduuranalyse en het profileren van nakomelingenproductie, is de preparatie van een leeftijdgesynchroniseerde populatie wormen essentieel. Gebruik een platina wormpicker om 20 tot 30 reproductief actieve volwassenen over te brengen naar verschillende reguliere NGM-platen.

Met OP 50. Afhankelijk van het aantal eieren dat nodig is voor de experimenten, kunnen meer volwassen exemplaren vereist zijn. Laat de platen vier uur bij 20 °C staan om eiafzetting mogelijk te maken.

Verwijder de volwassenen van de plaat en inspecteer de platen visueel op eieren. Laat de platen verder incuberen bij 20 °C zodat het nageslacht zich kan ontwikkelen tot het late L4- of dag 1 volwassen stadium. Voor N2 wild-type wormen bij 20 °C duurt dit gewoonlijk drie dagen.

Voor de analyse van de levensduur. Breng 10 tot 12 volwassen wormen van één dag oud over naar een SDR-plaat om de dieetrestrictie te starten. Gebruik in totaal 60 tot 100 wormen per SDR-conditie om voldoende statistische kracht te verkrijgen.

Beoordeel de levensvatbaarheid van elke worm elke twee tot drie dagen totdat alle wormen zijn gestorven. Het is van groot belang om de wormen om de dag over te brengen naar verse SDR-platen om uithongering te voorkomen. Deze kalibratiecurve zet de OP 50-concentratie uit tegen de OD 600.

De vergelijking die is gegenereerd via lineaire regressieanalyse kan worden gebruikt voor alle toekomstige berekeningen van de concentraties OP 50-bacteriën. Deze studie analyseert het effect van chronische SDR-behandelingen op de gemiddelde levensduur van verschillende wormstammen in vergelijking met een normale dosisafhankelijke respons van wild-type wormen op SDR. Het effect van SDR op de levensduur wordt gedeeltelijk onderdrukt door DR 2-overexpressie, terwijl de DAF 16 MU 86-mutatie geen effect heeft op de door SDR geïnduceerde verlenging van de levensduur.

Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u Dian uitvoert bij het standaard AGA-gebaseerde spel in sea elegance.