Transmembraan domein oligomerisatie Propensity bepaald door ToxR Assay

Het algemene doel van het volgende experiment is om de neiging tot ligamentisatie van eiwitten, transmembraandomeinen of TMD's in een natuurlijke membraanomgeving te onderzoeken. Dit wordt bereikt door het transmembraandomein van belang tot expressie te brengen in e coli als een chimerisch eiwit met maltose-bindend eiwit voor lokalisatie naar het periplasma en tox. R als transcriptionele reporter; door het transmembraandomein geïnduceerde ligamentisatie resulteert in dimerisatie van tox R en activatie van LXi-transcriptie. Als tweede stap worden de cellen gelyseerd en behandeld met ONPG, dat door beta-galacto wordt gehydrolyseerd tot de lichtabsorberende stof o-nitrofenolaat of ONP.

Vervolgens worden de ONP-niveaus gekwantificeerd door de lichtabsorptie bij 405 nanometer te meten. Om de niveaus van het transmembraandomein te bepalen, onthullen de resultaten van de ligandisatie de ligandisatie-neiging van de transmembraandomeinen op basis van een tox R-reporterassay. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande biofysische methoden, zoals SDS-PAGE of fluorescentie, is dat het gedrag van het transmembraandomein wordt bestudeerd in een natuurlijke fosfolipide dubbellaag door expressie in e coli, in plaats van in een membraan-mimetisch systeem zoals een detergent-micel.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van membraaneiwitten, zoals de verduidelijking van belangrijke structurele kenmerken die betrokken zijn bij de associatie van transmembraanhelices. Voorafgaand aan de start van dit protocol worden zeven plasmiden die het vereiste chimerische eiwit tot expressie brengen geprepareerd vanuit commercieel gesynthetiseerde oligonucleotiden, die de TDS van belang vertegenwoordigen geflankeerd door NHE one en BMH one restrictieplaatsen. Nadat de plasmiden zijn geprepareerd, worden fhk 12 competente cellen voorzichtig op ijs ontdooid. Zodra ze ontdooid zijn, worden de cellen overgebracht naar 15 milliliter cultuurbuisjes; voeg 200 nanograms van elk plasmide-DNA toe aan een apart buisje en incubeer de cellen gedurende 30 minuten op ijs.

Geef de cellen vervolgens een hitteshock van 90 seconden bij 42 °C, gevolgd door incubatie op ijs gedurende twee minuten in 800 µL SOC-medium. Incubeer de monsters gedurende één uur bij 37 °C onder schudcondities. Inoculeer na de incubatie 5 mL LB-medium met chloramphenicol en ampicilline met 50 µL van het transformatiemengsel, waarbij gebruik wordt gemaakt van 15 mL cultuurbuizen in triplikaat voor elk monster. Incubeer de monsters tot slot 20 uur bij 37 °C onder schudcondities. Om de ligatie-efficiëntie te meten, wordt de TDS bèta-galactosidase-activiteit bepaald.

Verwarm eerst de plaatlezer voor tot 28 °C. Gebruik de Z-bufferstokoplossing om verse Z-bufferoplossingen te bereiden zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Breng de Z-buffer chloroform over van de buis naar het reservoir, waarbij u er op let dat u alleen de bovenste waterige laag van de Z-buffer chloroform pipetteert.

Plaats de 96-wellplaat op een vel papier met een getekend raster om nauwkeurig pipetteren te garanderen. Breng 100 µL Z-buffer chloroform over naar elke well van een 96-wellplaat, gevolgd door vijf µL van elke cultuur in quadruplo. Laat de cultuur weg in de vier wells die als blanco's dienen. Meet de OD 595 van de plaat om de celdichtheid te bepalen.

Voeg 50 µL Z buffer SDS toe aan alle putjes van de plaat. Schud de plaat vervolgens 10 minuten in de plaatlezer om de cellen te lyseren. Voer na de cellyse de reactie uit door 50 µL ZPA voor ONPG aan alle putjes toe te voegen. Plaats de plaat terug in de plaatlezer en meet de OD 405 elke 30 seconden gedurende 20 minuten.

Bepaal het niveau van bèta-lactamase-activiteit via een berekening van Miller-eenheden, genormaliseerd ten opzichte van de blanco. Western blotting wordt uitgevoerd om de equivalente eiwitexpressie tussen constructen te verifiëren. Combineer eerst 50 µL van de tripelicaten culturen en centrifugeer de monsters vervolgens met een microcentrifuge.

Verwijder het supernatant met een pipet en resuspendeer. Suspendeer het resterende pellet in twee x monsterlaadbuffer; breng 7,5 microliters van elk monster aan op een standaard 8% gel en voer elektroforese uit bij 125 volt gedurende één uur en vijf minuten. Incubeer na de transfer het membraan met een anti-M-V-P-H-R-P-geconjugeerd antilichaam om het chimerische eiwit te visualiseren; dit is waarneembaar bij ongeveer 70 kilodaltons, waarbij soms degradatieproducten zichtbaar zijn rond 48 kilodaltons.

Endogeen MVP wordt ook waargenomen bij 45 kilodaltons. Om de juiste membraaninsertie van het chimerische TMD-construct te beoordelen, wordt de maltose-bindend eiwit-deficiënte PD 28-cellijn gebruikt; wanneer deze wordt gekweekt in minimaal medium met maltose als enige koolstofbron, kunnen alleen cellen groeien die een membraanintegraal expressieproduct met maltose-bindend eiwit tot expressie brengen dat correct in het periplasma is gelokaliseerd. Transformeer PD 28-cellen zoals beschreven voor fhk 12-cellen en inoculeer twee milliliters LB-medium.

Kweek de cellen na de incubatie gedurende de nacht bij 37 °C met schudden op 300 RPM. Pelleteer de cellen door centrifugatie en was deze door resuspensie in twee milliliter PBS en voorzichtig pipetteren met een grote tip. Na het pelletteren worden de cellen voor een tweede keer gewassen met PBS, gevolgd door een laatste centrifugatie en resuspensie in één milliliter PBS.

Gebruik 25 µL van de geresuspendeerde cellen om vijf milliliter minimaal medium te inoculeren. Incubeer de cellen bij 37 °C onder schudcondities gedurende 15 uur. Breng 200 µL van elk monster over naar een 96-wells plaat en bepaal de OD 595 met behulp van de platenlezer.

Herhaal dit proces elke twee uur tot 25 uur. De neiging tot ligamentisatie van individuele transmembraandomeinen van het meervoudig overspannen membraanintegraaleiwit latent membrane protein one werd geanalyseerd met behulp van de tox R transcriptionele reporterassay. Transmembraandomein vijf vertoont een sterke neiging tot ligamentisatie, aangetoond door hoge Miller-eenheden, wat vergelijkbaar is met de positieve controle GPAA, een goed gedocumenteerde dimeriserende sequentie.

Een schadelijke mutatie in transmembraandomein vijf D1 50 A vermindert het vermogen van de sequentie om LMP1 te ligeren; TM1 ligereert niet significant en vertoont een zeer laag Miller-unit-signaal net boven het signaal voor de blanco, wat niet-getransformeerde FHK 12-cellen zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kunt bepalen of een transmembraanhelix van belang in staat is om hogere-orde complexen te vormen in een natuurlijke membraanomgeving. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uiterst zorgvuldig in de 96-wells plaat te pipetteren om grote fouten te voorkomen en ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd.