Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van in vivo optische resolutie fotoakoestische microscopie, of PAM, van de microcirculatie die non-invasief en labelvrij is. Dit wordt bereikt door eerst het proefdier te anesthetiseren. De tweede stap van de procedure is het positioneren van het interessegebied door de beeldvormingskop van de optische resolutie fotoakoestische microscoop te verplaatsen; vervolgens worden de scanparameters ingesteld en wordt de beeldacquisitie gestart.

Uiteindelijk worden de distributies van de totale zuurstofconcentratie en de zuurstofsaturatie van hemoglobine verkregen door berekeningen met de experimentele gegevens van meerdere golflengten. Optische resolutie fotoakoestische microscopie is gebaseerd op laserstroomexcitatie en ultrasone detectie. Een korte laserpuls wordt gefocust in biologisch weefsel.

Lichtabsorptie veroorzaakt tijdelijke opwarming en daaropvolgende ultrasone emissie, die wordt opgevangen om een beeld te vormen. Het unieke voordeel van fotoakoestische microscopie (PAM) is dat het een labelvrije detectie is met een uitstekende gevoeligheid voor optische absorptie. In tegenstelling hiermee zijn bestaande reflectie- en optische microscopietechnologieën primair gevoelig voor optische verstrooiing of fluorescentie. In staat om in vivo labelvrije resolutiebeelden van optische absorptie te leveren, heeft PAM brede biomedische toepassingen gevonden in de neurologie, oogheelkunde, vasculaire biologie en dermatologie.

Fotoakoestische microscopie met optische resolutie, of pamm, bestaat uit zowel optische als ultrasone componenten. De optische bestralingsbron is een kleurstoflaser die wordt gepompt door een vaste-stofpulslaser. De uitgaande laserstraal wordt gedempt door een neutraal dichtheidsfilter en gekoppeld aan een enkelmodus optische vezel voor lichttoevoer, zodat de beeldvormingskop van de microscoop mechanisch gescand kan worden in plaats van het levende object, om de multimodus laserstraal effectief in een enkelmodus optische vezel te koppelen.

Het wordt eerst gefilterd door een pinhole met een diameter van 50 micrometer. De pinhole is iets verschoven ten opzichte van het brandpunt van de condensorlens geplaatst om de diameter ervan af te stemmen op de diameter van de fundamentele modusstraal. Om een nagenoeg diffractiebeperkt optisch brandpunt te creëren, wordt de output van de single-mode vezel gecollimeerd zodat deze de achteropening van een microscoopobjectief vult.

De ultrasone detectie maakt gebruik van een zelfgemaakte akoestisch-optische bundelcombinator die is verbonden met een ultrasone transducer. De combinator richt de optische bestraling en de akoestische detectie coaxiaal uit. In de bodem van de combinator is een sferische holte geslepen om een akoestische lens te creëren met een numerieke apertuur van 0,5 in water, wat een akoestische brandpuntdiameter van 43 µm oplevert bij de centrale frequentie van 50 MHz.

Voor de eerste uitlijning is het nuttig om puls-echo ultrasone metingen te gebruiken om de positie van het akoestische brandvlak te bepalen. De beeldvormingskop wordt verticaal afgesteld totdat het maximale puls-echo ultrasone signaal wordt waargenomen. Om de detectiegevoeligheid te maximaliseren, worden de optische en akoestische brandpunten confocal uitgelijnd.

Een optisch absorberend doelwit, zoals een stukje zwart isolatietape, wordt in het akoestische brandpuntsvlak geplaatst. Vervolgens wordt de optische brandpuntpositie aangepast om het foto-akoestische signaal te maximaliseren. Het PAM-systeem bevat daarnaast elektronische versterkers en een analoog-digitaal converter, een mechanische scanner en een scannercontroller.

Het gedigitaliseerde signaal wordt overgebracht naar een computer voor beeldvorming. De software zet de ruwe data om in een reeks dwarsdoorsnede-scanbeelden. Terwijl de microscoopkop het object rastert, kunnen de geregistreerde beelden vervolgens worden weergegeven als individuele dwarsdoorsneden, 2D-beelden met maximale amplitudeprojectie of 3D-renderings.

Een watertank wordt gebruikt om de beeldvormingskop van de microscoop te huisvesten. In een Petrischaal wordt een beeldvormingsvenster uitgesneden en afgedicht met een ultrasoon en optisch transparant polyethyleenmembraan. De foto-akoestische golf die door het object wordt gegenereerd, wordt eerst akoestisch gekoppeld aan de ultrasone detector via ultrasone gel tussen het object en het polyethyleenmembraan, en vervolgens via gedeïoniseerd water in de Petrischaal.

Deze uitvindingen en toepassingen van beschikbare optische lasers en de ultrasone transducer vormen het o-PAM-systeem. In het volgende segment zullen we met dit systeem de microvasculatuur van een levende muis in beeld brengen. Indien het dier dat wordt gescand geen naakte muis is, is het ideaal om het dier 24 uur voor het experiment te depileren.

Zo herstelt de irritatie van de huidvasculatuur zich. Anestheseer de muis met 3% isofluraan, verdampt in medische zuurstof. De gebruikelijke stroomsnelheid ligt tussen 1 en 1,5 liter per minuut.

Afhankelijk van het lichaamsgewicht van het dier. Handhaaf de anesthesie met 1% ISO-fluoraan. Voer gedurende het experiment een teenknijptest uit om er zeker van te zijn dat de muis volledig geanestheseerd is. Verplaats de muis naar een stereotactisch platform met een warmtemat om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden.

Strijk het oor nu plat op de plastic plaat. Breng vervolgens een laag echogel aan op het oor. Voorkom dat er luchtbellen in de gel ingesloten raken.

Breng daarnaast oogzalf aan in de ogen om uitdroging of onbedoelde laserschade te voorkomen. Vermijd direct contact tussen de applicator en het oog. Plaats vervolgens het oor onder het beeldvenster en breng de dierentafel langzaam omhoog totdat de echogel het onderste deel van het membraan raakt.

Een zacht contact is vereist, omdat het drukken van het oor tegen het membraan de bloedstroom in het oor kan beïnvloeden. Neem vervolgens enkele voorzorgsmaatregelen met het dier om de fysiologische status te bewaken. Bevestig een pulsoximeter aan het pootje of de staart van de muis.

Laat nu de beeldvormingskop zakken tot de akoestische lens is ondergedompeld in gedeïoniseerd water en verwijder luchtbellen die onder de akoestische lens vastzitten. Zet de laser in de externe trigger-modus en start een proefscan. Pas de Z-positie van de beeldvormingskop aan totdat de optische en akoestische dubbele brandpunten zich in het midden van het oor bevinden.

Stel nu de scanparameters in en start de formele beeldacquisitie. Om de totale hemoglobineconcentratie te meten, stelt u de golflengte in op een ISO-isobest punt waar oxyhemoglobine en deoxyhemoglobine gelijke molaire extinctiecoëfficiënten hebben.

Om de zuurstofsaturatie van hemoglobine te meten, stelt u de tweede golflengte in op een punt waar de molaire extinctiecoëfficiënten van oxyhemoglobine en deoxyhemoglobine een uitgesproken verschil vertonen. Maak na afloop het muisoor schoon en plaats de muis in een incubator. Terwijl de omgevingstemperatuur is ingesteld op 37 °C, brengt u de muis na het ontwaken op natuurlijke wijze terug naar de dierfaciliteit.

Deze afbeelding met maximale amplitudeprojectie toont de vasculaire anatomie van het oor van een levende naakte muis, gefotografeerd met oPAM bij 570 nanometer. Deze projectieafbeelding toont de zuurstofsaturatie van hemoglobine in hetzelfde oor. Deze is berekend op basis van de beelden die zijn verkregen bij een isosbestische golflengte van 570 nanometer en een golflengte die dominant is voor de absorptie van deoxyhemoglobine van 561 nanometer.

Een nadere blik op het omkaderde gebied toont de resolutie van oramm. Een dicht opeengepakt capillair bed is duidelijk zichtbaar. In deze video hebben we het typische experimentele protocol voor ORPM gedemonstreerd, inclusief de systeemconfiguratie, de systeemauslijning, de in vivo experimentele procedure en het functionele beeldvormingsschema.

Een van de belangrijkste aspecten bij het ontwerp en de werking van het instrument is de optisch-akoestische confocale uitlijning, die cruciaal is voor de beeldgevingsgevoeligheid en de optische resolutie. Fotoakoestische microscopie, in combinatie met diep penetrerende akoestische resolutie fotoakoestische microscopie en fotoakoestische computertomografie, maakt in vivo functionele en moleculaire beeldvorming op meerdere schalen mogelijk; van cellen, weefsels tot aan organen kan met hetzelfde contrast worden afgebeeld. Deze schaalbaarheid van de beeldvorming biedt het potentieel om onderzoek in biologische systemen op meerdere schalen en translationeel onderzoek te revolutioneren, van microscopische laboratoriumontdekkingen tot macroscopische klinische praktijk.