Lensfree On-chip Tomografische Microscopie Gebruikmakend van Multi-angle Verlichting en Pixel Super-resolutie

Het algemene doel van deze procedure is om lensvrije on-chip driedimensionale beeldvorming van biologische monsters over een groot beeldvolume te realiseren. Dit wordt bereikt door eerst het monster direct op de sensorkit te plaatsen en gedeeltelijk coherente belichting te bieden. De tweede stap is om de lichtbron zijdelings te verschuiven naar verschillende posities om opnames te maken.

Holografische beelden van het monster met verschoven subpixels. Volgende subpixels verschoven. Holografische beelden worden opgenomen bij veelvouden van de belichting voor tomografische beeldvorming.

De laatste stap is de gegevensverwerking, waarbij de verkregen dataset digitaal wordt gereconstrueerd om uiteindelijk driedimensionale tomografische beelden van het monster te verkrijgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele lichtmicroscopie, is dat deze high-throughput imaging in een compacte architectuur mogelijk maakt. Dit maakt ons platform bijzonder geschikt voor integratie met Lebanon-chipplatforms.

In dit verslag wordt de basisopstelling voor beeldvorming beschreven voor een benchtop-implementatie gericht op tomografie van statische monsters. Een monochromator met een xenonlamp werd ingesteld om een output te genereren met een spectrale breedte van ongeveer 1 tot 10 nanometer rond een centrumgolflengte van 450 tot 650 nanometer. Deze gedeeltelijk coherente output wordt vervolgens gekoppeld aan een multi-mode optische vezel om gedeeltelijk coherent licht naar het systeem te geleiden.

De optische vezel is gemonteerd op een gemotoriseerde rotatiepodium om de belichtingshoek te variëren. Het gemotoriseerde podium met de bevestigde lichtbron is gemonteerd op een tweedimensionaal lineair XY-podium, dat wordt gebruikt om vlakverschuivingen van de lichtbron bij een bepaalde hoek voor detectie te realiseren. Er wordt gebruikgemaakt van een A-C-M-O-S-sensorarray met vijf megapixels en een pixelgrootte van 2.2 microns.

De detector wordt gebruikt om holografische beelden van monsters met een breed gezichtsveld vast te leggen. Het is essentieel dat de sensorarray zich in hetzelfde axiale vlak bevindt als de rotatieas van de lichtbron, om te controleren of de sensor voldoende licht ontvangt bij grote invalshoeken. Hoewel lensvrije optische tomografie in staat is om diverse objecten zoals cellen en micro-organismen in beeld te brengen, worden de basisprincipes hier gedemonstreerd door middel van driedimensionale microscopie van een monster van een zee-elg, waarbij een scalpel of een spatel wordt gebruikt.

Neem een klein stukje AGA uit de Petrischaal met de kweek van de sealer-organen. Een kubusvormig stukje van enkele millimeters per zijde bevat honderden nematoden. Plaats het kleine stukje agar in een polypropyleenbuisje met één milliliter gedeïoniseerd water.

Vortex voorzichtig gedurende 30 seconden tot één minuut. Na 10 tot 15 minuten zou de worm uit de agar in het gedeïoniseerde water moeten kruipen. Let op dat de wormen hier te klein zijn om te zien om de wormen tijdelijk te immobiliseren en één milliliter van vijf tot 10 millimolair Lima.

Voeg de oplossing toe en wacht 10 minuten. Pipetteer vijf tot 10 µL monster van de bodem van het vial en plaats dit tussen twee dekglasplaatjes. Dit monster, dat een groot aantal tijdelijk geïmobiliseerde wormen bevat, kan op de detector worden geplaatst om de gegevensverwerving te starten.

Ten behoeve van de demonstratie worden de stappen voor beeldacquisitie voor een typisch lensvrij optisch tomografie- of LOT-experiment in deze sectie samengevat; het gehele proces is echter geautomatiseerd middels de eigenstondig ontwikkelde LabVIEW-interface. Om met de handmatige stappen te beginnen, stelt u de beginhoek van de rotatietafel in op -50 graden, waarbij nul graden overeenkomt met de verticale positie van de lichtbron. Stel de beginpositie van de XY-tafel in op 0 0, wat de homepositie is.

Pas de belichtingstijd van de detector aan om het dynamisch bereik optimaal te benutten, zodat het beeld zo helder mogelijk is zonder verzadigde pixels, zonder de hoek van de rotatietafel te wijzigen. Leg negen beelden vast voor elk beeld. Verplaats de XY-tafel naar een nieuwe positie in een raster van drie bij drie, zodanig dat elk beeld ongeveer een kwart pixel verschuift ten opzichte van het vorige.

Het verkrijgen van meer beelden onder elke hoek kan de resolutie verbeteren, afhankelijk van het type object en de signaal-ruisverhouding. Nadat er negen beelden onder de beginhoek zijn verzameld, moet de positie van de XY-tafel worden teruggezet naar de nulpositie. Vergroot vervolgens de hoek van de rotatietafel in stappen van twee graden tot een positieve waarde van 50 graden is bereikt.

Herhaal de beschreven stappen na elk interval bij elke nieuwe hoek. De hoekintervallen kunnen fijner of grover zijn, afhankelijk van de optimalisatie van de acquisitietijd ten opzichte van de beeldresolutie. Na de data-acquisitie wordt een set van 459 beelden verkregen, die negen met subpixels verschoven beelden bevatten voor elk van de 51 verschillende belichtingshoeken.

Elke set van negen afbeeldingen wordt digitaal verwerkt met behulp van pixel-superresolutie-algoritmen om één projectie met een hoge resolutie te verkrijgen. De resultaten van de pixel-superresolutie per hologram per hoek worden vervolgens digitaal gereconstrueerd om 51 projectiebeelden te verkrijgen. De gegevensverwerking wordt hier getoond met behulp van een laptop.

De reconstructie van het volledige gezichtsveld zou minder dan één seconde in beslag nemen bij gebruik van grafische verwerkingseenheden. Deze set van 51 projectiebeelden wordt vervolgens teruggeprojecteerd met behulp van de Tom OJA-plugin. Voor Image J worden de projectiebeelden eerst in Image J geladen, waarna de Tom OJ-plugin wordt aangeroepen.

Een opzoektabel die de kijkhoek voor elke projectieafbeelding verschaft, wordt geladen in OJ. Met behulp van de gewogen terugprojectiemethode kunnen driedimensionale tomografische beelden van het specimen worden verkregen. Het grote gezichtsveld van lensvrije optische tomografie wordt hier aangetoond doordat het monster direct op de detectorarray wordt geplaatst. Holografische beelden van de objecten kunnen worden vastgelegd over een gezichtsveld van 24 millimeter vierkant, wat verder kan worden uitgebreid met behulp van nieuwe detectorarrays met grotere actieve oppervlakken.

Hoewel de pixelgrootte van de detectorarray de resolutie van de geregistreerde holografische beelden beperkt, verminderen pixel-superresolutietechnieken dit probleem. Hier worden pixel-superresolutie-hologrammen getoond, samen met de gereconstrueerde projectiebeelden die een submicrometer ruimtelijke resolutie bieden voor drie verschillende belichtingshoeken. De projectiebeelden kunnen worden gecombineerd met behulp van tomografische beeldreconstructietechnieken om tomogrammen van het specimen te berekenen. Hier worden drie slice-beelden in het XY-vlak door het anterieure deel van de worm getoond, waarbij de faryngeale buis alleen zichtbaar is in de slice door Z = 8 µm, zoals verwacht bij deze ruwweg cilindrische structuur met een buitenste diameter van ongeveer 5 µm.

Bovendien laat het dwarsdoorsnedebeeld in het XZ-vlak duidelijk de grenzen van de worm en de faryngeale buis binnenin zien, wat de succesvolle 3D-beeldvorming van de pharynx aantoont. Met verdere ontwikkeling kan deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers om driedimensionale microscopie uit te voeren over beeldvolumes van buizen van tientallen millimeters. Daarom kan lensvrije optische tomografie een nuttig instrument zijn voor high-throughput beeldvormingsapplicaties in lab-on-a-chip platforms.