High-throughput screening 'en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

Deze video demonstreert een methode voor het kweken en uitplaten van fluorescerende stammen van CL gans voor high-throughput screening van chemische bibliotheken of detectie van milieuverontreinigingen om het effect van chemische of milieu-factoren op specifieke eiwitactiviteit te beoordelen. Bij CL elgan worden eerst bacteriële culturen bereid als voedsel voor de wormen en worden GFP-transgene, gesynchroniseerde wormen gekweekt.

Vervolgens worden 0,5 tot 2 miljoen wormen verzameld, gewassen en verdeeld over drie 84-wells microtiterplaten, waarna kleine moleculen uit een chemische bibliotheek of testmonsters zoals water, voedsel of bodem aan de wormen worden toegevoegd. Tot slot wordt de fluorescentie van de wormen gemeten met een microplaatlezer.

Data-analyse van fluorescentie-intensiteiten onthult kleine moleculen die induceerbare transcriptionele paden moduleren of die de detectie van milieuverontreinigingen mogelijk maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in vitro- en celkweekgebaseerde assays, is dat er geen tijd wordt verspild aan verbindingen die in vivo toxisch of inactief zijn. Deze high-throughput methode kan helpen bij het identificeren van kleine moleculen die diverse induceerbare paden moduleren.

Hoewel we deze methode hebben ontwikkeld voor high-throughput screening van bibliotheken met kleine moleculen, kan deze ook worden toegepast voor biosensing van contaminanten in voedingsmiddelen en milieu-monsters. De procedure zal worden gedemonstreerd door Andrew Dine, een technicus in mijn laboratorium, en Q long, een postdoc in mijn laboratorium. Bereid het bacteriële wormvoeder vooraf.

Begin met het inoculeren van 500 milliliters terrific broth, aangevuld met 50 micrograms per milliliter streptomycine, met vijf milliliters verzadigde e coli. OP 50. Plaats de cultuur op een schudapparaat en laat deze overnacht groeien bij 37 degrees Celsius.

Verdeel de cultuur de volgende dag over tien buisjes van 50 milliliter. Plaats de buisjes vervolgens in een gekoelde centrifuge en centrifugeer ze 20 minuten bij 2.500 RCF. Resuspendeer na het centrifugeren elke bacteriële pellet in 10 milliliter vloeibaar nematode-groeimedium of NGM.

Schud de suspensies horizontaal. Gebruik een orbitalschudder gedurende 15 minuten om de bacteriën opnieuw te suspenderen. Centrifugeer vervolgens de bacteriecultuur bij 2.500 RCF bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten.

Giet het NGM af en weeg het bacteriële pellet. Voeg vervolgens een gelijk volume NGM-buffer toe en resuspendeer de pellets door middel van vortexen. Verdeel tot slot drie milliliter van de geresuspendeerde bacteriecultuur in buisjes van 15 milliliter en bewaar deze bij minus 20 graden Celsius tot ze nodig zijn.

In deze demonstratie zal het effect van de stress-inducerende Xeno Duke lening op de transcriptiefactor Sskn one worden gemeten als voorbeeld. Sskn one staat erom bekend cytoprotectieve genen te activeren tijdens oxidatieve en xenobi stress. Er wordt een grootschalige cultuur voorbereid van de Trenchgenic c gans-lijn VP 5 96, die twee fluorescerende constructen bevat.

VP 5 96 wormen brengen zowel de GST vier promoter tot expressie die GFP aanstuurt, wat wordt gebruikt om de activiteit van de transcriptiefactor te monitoren, als de Sskn één en de DOP drie promoter die RFP aanstuurt, wat wordt gebruikt als standaard voor de normalisatie van het aantal wormen.

DOP three is de promotor voor een dopaminereceptor en wordt constitutief tot expressie gebracht in neuronen door het hele lichaam. In het voorbeeld, aangezien de xenobi lon sskn one sterk activeert en de hoeveelheid GFP die vanaf de GS T four promotor wordt tot expressie gebracht verhoogt, begint u ter voorbereiding van de culturen met het mengen van 150 milliliters N NGM-buffer, 1,5 milliliters LB, 150 microliters 1 molar cholesterol en 75 microliters 100 milligrams per milliliter Streptomycine. Het toevoegen van LB helpt te voorkomen dat de wormen aan het glaswerk en plasticware kleven, maar deze hoeveelheid is onvoldoende om bacteriële groei te ondersteunen.

Filtreer het mengsel om het te steriliseren, breng het vervolgens over naar een steriele kolf van één liter en zet de kolf apart om de eieren uit de volwassen GR-wormen te laten vrijkomen. Was de bacteriën van de wormen door ze te centrifugeren en het NGM-medium te vervangen totdat het supernatant helder is. Was de wormen een tweede keer door ze te resuspenderen in steriel water en na het centrifugeren opnieuw te centrifugeren.

Verwijder het supernatant en vul de buis met 3,75 milliliters steriel water. Voeg één milliliter huishoudbleekmiddel en 250 microliters 10 normaal natriumhydroxide toe en meng dit onmiddellijk door de buis vijf tot zes keer om te keren. Plaats de buis in een rotator nadat de wormen gedurende vier minuten aan het bleekmiddel zijn blootgesteld.

Plaats de buis onder een stereomicroscoop. De meeste volwassen wormen zouden gelyseerd moeten zijn. Schud de buis krachtig 15 tot 20 keer om de resterende volwassen wormen te lyseren. Nadat de lysering in totaal vijf minuten heeft geduurd, voegt u steriel water toe tot de buis vol is.

Meng door vijf tot zes keer te keren om de eieren te verzamelen. Centrifugeer de buis gedurende één minuut bij 500 RCF. Was de eieren drie keer door ze te resuspenderen in 10 milliliters steriel water, te centrifugeren en het supernatant te verwijderen.

Verdun vervolgens een monster van 100 µL eieren 100-voudig door 10 mL NGM-buffer toe te voegen. Pipetteer daarna drie aliquoten van 5 µL op het deksel van een Petrischaal onder een microscoop. Tel het aantal eieren in drie afzonderlijke aliquoten van 5 µL.

Om het totale aantal eieren te schatten: voeg 200.000 tot 2 miljoen eieren toe aan de kolf met NGM-buffer en schud de cultuur met 100 RPM bij 20 °C. Ten minste 16 uur nadat de eieren aan de kolf zijn toegevoegd, wordt een steriele serologische pipet gebruikt om ongeveer 0,5 ml van de gesuspendeerde wormencultuur te verwijderen.

Pipetteer drie druppels van 5 µL op het steriele deksel van een Petrischaal. Plaats het deksel gedurende één tot twee minuten in een vriezer van -20 °C om de wormen te verlammen. Tel, zodra de wormen verlamd zijn, het gemiddeld aantal levende uitgekomen wormen per 5 µL met een stereomicroscoop om het totaal aantal te schatten.

Ontdooi de eerder bereide bevroren OP 50 bacteriële cultuur door deze enkele minuten op de werkbank te plaatsen. Voeg vervolgens drie milliliters 50% OP 50 toe per 500.000 uitgekomen wormen. Schud de kolf met 100 RPM bij 20 °C.

De wormen zullen in ongeveer 51 uur uitgroeien tot L4-larven en jonge volwassen stadia. Controleer de hoeveelheid bacteriën gedurende de incubatie door middel van visuele inspectie. Voeg meer bacteriën toe als het medium helder wordt.

Gebruik een steriele serologische pipette om ongeveer 0,5 milliliter van de gesuspendeerde wormcultuur over te brengen naar een standaard NGM-agarplaat. Bekijk de wormen met een stereomicroscoop om te controleren of het merendeel L4-larven en jonge volwassenen zijn; onder brightfield-microscopie vertonen L4-larven een heldere ventrale vlek in het midden van het lichaam. Jonge volwassenen zijn iets groter en hebben geen heldere vlek.

Trek vervolgens de wormcultuur in steriele buizen van 50 milliliter. Plaats de buizen in een reageerbuisrek in de zuurkast en laat niet-uitgekomen eitjes of wormen die zich niet ontwikkelen bezinken. Deze bezinken langzamer dan ontwikkelde wormen.

Verwijder na 10 minuten het supernatant, dat niet uitgekomen en onontwikkelde wormen bevat, via aspiratie, voeg ongeveer 10 milliliters NGM-buffer toe aan elk pellet en suspendeer de wormen door voorzichtig met de buisjes te draaien. Verzamel alle wormen in één enkele buis van 50 milliliter. Centrifugeer in een centrifuge met zwaaibekers bij 500 RCF gedurende 30 seconden.

Resuspendeer de wormen vervolgens in 50 milliliters NGM met 1%lb om ze te wassen. Herhaal dit; was drie tot vier keer om de bacteriën na het wassen te verwijderen. Vul de buis aan met NGM plus LB-buffer tot 50 milliliters.

Giet dit in een speciale fles voor het dispenseren van wormen met een roerstaf en plaats deze op een roerplaat. Er is een minimum van ongeveer 20 milliliters of 60 000 wormen nodig om de dode ruimte in de dispenserfles en de dispensercassette te vullen. Tel het aantal wormen in drie druppels van vijf microliter, zoals eerder gedemonstreerd.

Na het tellen bij NGM plus LB tot een concentratie van 12 tot 15 wormen per druppel van vijf µL, heeft elke 84-wells plaat ongeveer 35.000 wormen of 11,5 mL gesuspendeerde wormen nodig. Plaats een doseercassette van 10 µL in de dispenser en steriliseer deze door te primen met 70% ethanol. Spoel de ethanol weg door te primen met steriel water.

Plaats het uiteinde van de doseercassette in de kolf, zodat deze net boven de roerkolf staat zonder de beweging ervan te hinderen. Zorg ervoor dat de wormen gedurende het proces in de hele kolf gesuspendeerd blijven. Programmeer de dispenser om de wormen op lage snelheid te doseren met twee voorpulsen (prime) en laat ten minste 10 milliliters gesuspendeerde wormen doorlopen.

Vul de microtiterplaten, die al testverbindingen moeten bevatten, snel om te voorkomen dat de wormen in de slang bezinken. Hier dient de testverbinding die eerder op de microtiterplaat is geladen te worden gebruikt. Glow. Verzegel de platen met ademend plakband om te voorkomen dat er stof in de wells verzamelt.

Plaats de platen op een schudplatform in een incubator bij de juiste temperatuur voor de assay. Stapel de platen niet op elkaar, omdat dit de luchtstroom kan beperken. Plaats de doelplaat in een microplaatlezer om de fluorescentie-intensiteit van elke well te meten met de juiste emissie- en excitatielengten.

De filters die voor GFP worden gebruikt, hebben een excitatie van 485 en een emissie van 528. De filters voor RFP hebben een excitatie van 540 en een emissie van 590. Bereken na het uitlezen van de plaat de verhouding tussen GFP en RFP en normaliseer dit met de waarden van de controleputjes, die geen activerende verbinding bevatten, om het exactevoudige verschil in fluorescentie-intensiteit als gevolg van de individuele behandelingen te bepalen.

De hier getoonde SSKN one-assay maakt gebruik van een chromosomaal geïntegreerde dubbele reporterstam, waarbij de wormen handmatig werden geteld met een stereomicroscoop. Het aantal wormen correleerde met het gedoseerde volume met een R-kwadraatwaarde van 0,94 en een p-waarde van minder dan 0,0001. Dit geeft aan dat het aantal wormen dat in elke put wordt gedoseerd, kan worden gecontroleerd door het gedoseerde volume aan te passen.

De totale GFP-fluorescentie per well, links afgebeeld, en de RFP-fluorescentie per well, rechts afgebeeld, zijn in deze figuren zeer reproduceerbaar tussen de wells over een 384-well plaat. De XS geven de relatieve fluorescentie aan die in elke well is gemeten. Doorlopende lijnen geven de gemiddelden aan en stippellijnen geven drie standaarddeviaties boven of onder het gemiddelde aan; de fluorescentie van alle wells had een variatiecoëfficiënt van minder dan 9%. Zoals in deze figuur wordt getoond, is de GFP-fluorescentie van de GST-4-promotor lineair gecorreleerd met de RFP-fluorescentie van de DOP-3-promotor over 384 wells, met een R²-waarde van 0,62 en een p-waarde van minder dan 0,0001.

Daarom kan de niet-induceerbare RFP-reporter worden gebruikt om de induceerbare GFP-reporter te normaliseren. Wanneer dit gebeurt, wordt de ratio van GFP- ten opzichte van RFP-fluorescentie zeer reproduceerbaar van put tot put over een 384-wells plaat.

Het berekenen van de ratio van GFP ten opzichte van RFP reduceerde de variatiecoëfficiënt tot onder de 6%, wat de mogelijkheid van de DOP three promoter RFP-reporter demonstreert om de variabiliteit te verminderen, zoals hier wordt getoond. De inductie van GFP ten opzichte van RFP met een SK N one-activerend xenobioticum is robuust en zeer reproduceerbaar over een 384-well plaat; de gemiddelde relatieve fluorescentieratio's van alle controle-wells en due GLO-wells zijn aangegeven met ononderbroken lijnen. Drie standaarddeviaties boven het gemiddelde van de controle en onder het gemiddelde van dlo zijn aangegeven met streeplijnen.

Zodra de methode onder de knie is, kan het opzetten van een wormcultuur op de eerste dag in ongeveer één uur worden voltooid, evenals het verzamelen en uitpipetteren. Het verzamelen en uitpipetteren van wormen kan in ongeveer twee uur worden gedaan als dit correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat men moet beginnen met ten minste 60.000 wormen en deze in suspensie moet houden tijdens het uitpipetteren; door deze procedure te volgen kunnen screens met andere, bijvoorbeeld reporter-strains voor andere induceerbare pathways, worden uitgevoerd om na de ontwikkeling modulatoren voor andere pathways te ontwikkelen.

Deze techniek kan de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van high-throughput screening en biosensing om snel modulatoren van kleine molecuulpaden te identificeren of milieuverontreinigingen te detecteren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u fluorescerende elegan-stammen moet kweken, dispenseren en meten voor high-throughput screening van induceerbare transcriptionele paden of het testen van meerdere monsters op milieuverontreinigingen.