Voorbereiding, Zuivering en karakterisering van lanthanide-complexen voor gebruik als contraststoffen voor Magnetic Resonance Imaging

Het algemene doel van deze procedure is het synthetiseren, zuiveren en karakteriseren van lanthaanbevattende complexen die kunnen worden gebruikt voor het markeren van biologische macromoleculen. Dit wordt bereikt door eerst het metaalstartmateriaal en de ligand te mengen, terwijl de pH van de oplossing wordt gecontroleerd. De tweede stap van de procedure is het zuiveren van het resulterende complex middels dialyse.

Vervolgens moet de afwezigheid van vrij metaal worden geverifieerd. De laatste stap van de procedure is de karakterisering van de eigenschappen van het complex die relevant zijn voor beeldvorming. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat de gesynthetiseerde complexen zich als contrastmiddelen zullen gedragen door middel van relaxiviteitsmetingen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de beeldvorming, zoals de vraag of het coördinatiegetal van water voor een contrastmiddel verandert bij binding aan een eiwit. Over het algemeen zullen personen die deze methode nodig hebben moeite ondervinden, omdat het nauwkeurig beheersen van de pH ertoe zal leiden dat de LI onbruikbaar wordt voor bio-educatie. Het demonstreren van de dialyse en de activiteitsmetingen zal worden uitgevoerd door Buda en Sashi.

Promovendi uit mijn laboratorium. Om de methation te starten met lanthaanzouten, los eerst één equivalent ligand op in water om een oplossing van 30 tot 265 millimolair te verkrijgen. Het ligand Paraiso Benzyl DTPA wordt hier gebruikt in een concentratie van 73 millimolair. Pas vervolgens de pH van de ligandoplossing aan naar een waarde tussen 5,5 en 7 door toevoeging van een molaire ammoniumhydroxide.

In deze video worden 0,2 milliliter van de één molaire ammoniumhydroxide-oplossing gebruikt om één tot twee equivalenten lantaanoïdechloride in water op te lossen om een oplossing te verkrijgen met een concentratie van vijf tot 1000 millimolair. Er kan ofwel europiumchloride of gadoliniumchloride worden gebruikt in concentraties van 111 millimolair. Vaak wordt een overmaat aan metaal gebruikt om de precipitatie volledig te laten verlopen en daarmee de zuivering te vereenvoudigen.

Voeg vervolgens elke lantaanzoutoplossing onder roeren toe aan de bereide ligandoplossing. Stel nu de pH van de resulterende reactiemengsels in op een waarde tussen 5,5 en zeven door 0,2 molar ammoniumhydroxide toe te voegen. Hierbij wordt in totaal 0,5 milliliter van de 0,2 molar ammoniumhydroxide-oplossing gebruikt om de oplossing aan te passen.

Als het gebruikte ligand zuurgevoelige functionele groepen bevat, dient de pH tijdens deze stap meerdere keren te worden aangepast. Wees voorzichtig bij het aanpassen van de pH, want als de oplossing te basisch wordt, worden alle basegevoelige functionele groepen, zoals isothiocyanaat, onbruikbaar. Monitor de reactie bij conjugatie nauwgezet via pH-metingen.

De reactie is voltooid wanneer de pH constant blijft. Voor liganden zonder basegevoelige functionele groepen kan een opwerking waarbij de pH wordt verhoogd ook nuttig zijn. Bepaal om te beginnen met de dialyse-opwerking een geschikte lengte dialyseslang om het monstervolume te bevatten, plus extra lengte om een aanvullend volume van 10% van het monster te kunnen bevatten. Volg vervolgens de richtlijnen van de fabrikant om de slang op deze lengte af te snijden.

In deze video werd een membraan gebruikt met een moleculaire gewichtsafsnijding van 100 tot 500 Dalton, maar indien van toepassing kunnen membranen met een hogere moleculaire gewichtsafsnijding worden gebruikt als de conjugatie vóór de methation wordt uitgevoerd. Week, indien van toepassing en op basis van de richtlijnen van de fabrikant, de afgesneden dialysevliesbuis 15 minuten in water bij omgevingstemperatuur. Vul vervolgens een dialysereservoir met water, dat als dialysaat zal dienen. Hier is een bekerglas van één liter gebruikt.

Het volume van het dialysaat moet ongeveer 100 keer dat van het monster zijn. Vouw nu één uiteinde van de slang twee keer en zet het gevouwen gedeelte vast met de dialysesluitingsklem. Omwikkel het uiteinde van de sluiting met een elastiekje om er zeker van te zijn dat deze tijdens de dialyse gesloten blijft.

Filter het eerder bereide reactiemengsel door een filter van 0,2 micron. Breng vervolgens het filtraat aan in het open uiteinde van de slang. Wees voorzichtig om de slang niet te scheuren.

Zorg ervoor dat er voldoende hoofdruimte overblijft om de slang te sluiten. Vouw het resterende open uiteinde van de slang twee keer om en zet dit vast met een sluiting, waarna u de sluiting met een elastiekje vastzet. Bevestig vervolgens een glazen vials met lucht aan de klem aan één uiteinde van de dialyseslang met behulp van een ander elastiekje.

Bevestig vervolgens een buisje met zand aan de andere klem. Deze buisjes zorgen ervoor dat de slang ondergedompeld blijft in het dialysaat. Plaats nu de volledige slang in het dialysereservoir dat dialysaat bevat.

Roer het dialysaat met een magnetische roerplaat op een lage snelheid bij omgevingstemperatuur. Zorg ervoor dat de roersnelheid laag blijft en dat de oplossing niet wordt gevortext. Vervang het dialysaat drie keer gedurende één dag.

In deze video wordt het dialysaat vervangen na 2,5, 6,5 en 11,5 uur. Laat de dialyse gedurende de nacht doorgaan voor een totaal van 20 tot 28 uur. Zodra de dialyse is voltooid, verwijdert u de slang uit het dialysaat en opent u voorzichtig één sluiting om het monster te verwijderen.

Was de dialysebuis drie keer met water en voeg het waswater samen met het monster. Verwijder tot slot het water uit het monster onder verlaagde druk. Dit gebeurt door middel van vriesdrogen.

Het monster wordt ingevroren en vervolgens in een vriesdroogapparaat geplaatst. Om de aanwezigheid van vrij metaal in het monster te beoordelen, wordt eerst een acetaatbuffer bereid door 1,4 milliliters azijnzuur op te lossen in 400 milliliters water, waarna de pH met één molar ammoniumhydroxide wordt ingesteld op 5,8 en water wordt toegevoegd tot een totaalvolume van 500 milliliters. Los vervolgens 0,3 milligram van elk complex op in 0,3 milliliters buffer.

Bereid nu de xol-oranje-indicator, die een concentratie van 16 µM in de pH 5,8 buffer moet hebben. Voeg drie milliliter van deze indicatoroplossing toe aan de eerder opgeloste metaalcomplexen. Detecteer de aanwezigheid van vrij metaal door te observeren of de kleur van de indicator verandert van geel naar violet.

Indien gewenst kan de hoeveelheid vrij metaal worden gekwantificeerd door een kalibratiecurve op te stellen. Als er vrij metaal overblijft, moet het monster verder worden gezuiverd met dialyse of hogedrukvloeistofchromatografie vóór de karakterisering. Bereid vervolgens, om het watercoördinatiegetal voor een opiummonster te bepalen, een oplossing voor van ongeveer één millimolair van het complex bevattende opium in water, en daarna een andere oplossing van dezelfde concentratie in deuteriumoxide.

Voorafgaand aan de analyse moet de deuteriumoxide-oplossing drie keer worden verdampt en opgelost in deuteriumoxide om resterend water te verwijderen. Zet de spectrofluorimeter aan, voeg de waterige oplossing toe aan een schone cuvet en plaats de cuvet in de spectrofluorimeter. Voer nu de excitatie- en emissiemetingen uit om de maxima voor beide te bepalen, respectievelijk op ongeveer 395 nanometer en 595 nanometer. Voer vervolgens een fosforescentie-tijdsvervalexperiment uit met de zojuist bepaalde excitatie- en emissiegolflengten en de hier weergegeven parameters.

Herhaal deze stap met een bereide deuteriumoxidemoplossing. Zet op basis van de zojuist verkregen luminescentie-vervalgegevens de natuurlijke logaritme van de intensiteit uit tegen de tijd. De hellingen van deze lijnen zijn de vervalsnelheden. In deze video is Microsoft Excel 2007 gebruikt om de natuurlijke logaritme-grafieken uit de ruwe gegevens te genereren.

Gebruik de vervalsnelheden in de vergelijking die is ontwikkeld door Hors en medewerkers, zoals hier weergegeven. Als uw ligand OH- of NH-groepen bevat die gecoördineerd zijn aan het metaal, moet de vergelijking vóór gebruik worden aangepast. Om eerst de relativiteitsmetingen van het monster te bepalen, selecteert u de gewenste applicatiemodus op de relaxatietijdanalyser, T one of T two.

Hier wordt de T1-instelling geselecteerd. Bereid vervolgens een reeks monsters voor die verschillende concentraties van het lanthanoïde-bevattende complex in een waterig oplosmiddel bevatten. Hierbij wordt water als oplosmiddel gebruikt en zijn de oplossingen 2,5, 1,25, 0,625 en 0.

Millimolaire oplossingen worden bereid. Andere geschikte oplosmiddelen of buffers kunnen worden gebruikt, maar het is belangrijk om het oplosmiddel als blanco te gebruiken. Het uiteindelijke volume van de monsteroplossing is specifiek voor het gebruikte instrument.

Plaats een monster in het instrument en laat het vijf minuten staan om te equilibreren naar de temperatuur van het instrument, welke 37 °C is voor de eenheid die in deze video wordt gebruikt. Bepaal nu de relaxatietijd in seconden door de parameters van de software aan te passen om een vloeiende exponentiële curve voor T1 of T2 te verkrijgen. Herhaal dit voor alle monsters, inclusief de blanco.

Bereken nu de inverse van de gemeten T1- of T2-relaxatiewaarden en zet deze uit. Zet deze waarden uit tegen de lanthaanconcentratie in millimolaire eenheden en pas een lineaire regressie toe op de grafiek. De helling van de gefitte lijn is de relaxiviteit, respectievelijk R1 of R2 voor T1 en T2.

Hier zien we het algemene schema voor methylering en zuivering. Dit schema beeldt de algemene procedure voor methylering uit en de redenen voor het kiezen van verschillende zuiveringsroutes. Hier zien we een representatieve plot van de luminescentie-afname, waarin de natuurlijke logaritme van de afname is uitgezet tegen de tijd; de hellingen van de lijnen die zijn gegenereerd uit vergelijkbare curven voor water- en deuteriumoxide-oplossingen worden gebruikt met vergelijking één om het watercoördinatiegetal van europiumhoudende complexen te bepalen.

Een representatief voorbeeld van livity-metingen is hier te zien, waarbij de helling van de gefitte lijn de T one livity van het monster is. Naast het coördinatiegetal van water en de livity-karakterisering die in het protocol worden beschreven, is het ook belangrijk om de eindproducten te karakteriseren met behulp van standaard chemische technieken. De identiteit van de verbinding kan worden bepaald met massaspectrometrie; representatieve massaspectra die de diagnostische isotopenpatronen voor complexen met gadolinium en opium tonen, worden hier weergegeven.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals FTIR-spectroscopie, HPLC en elementanalyse, worden uitgevoerd om de resulterende complexen verder te karakteriseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe lantaanhoudende complexen kunnen worden gesynthetiseerd, gezuiverd en gekarakteriseerd die kunnen worden gebruikt voor het labelen van biologische macromoleculen.