Geautomatiseerde hydrofobe interactiechromatografie Kolomselectieopties voor gebruik in Protein Purification

Het algemene doel van deze procedure is het selecteren van een optimale HI-vloeistofchromatografiekolom met behulp van een geautomatiseerde scoutingmethode voor de zuivering van een recombinant eiwit met een BioRad DUO flow medium pressure vloeistofchromatographiesysteem. Dit wordt bereikt door eerst de benodigde buffers en bacteriële lysaten te bereiden die het betreffende recombinante eiwit bevatten. Vervolgens wordt het duo flow chromatographiesysteem fysiek opgezet, aangesloten en voorbereid voor het scoutingprotocol.

Vervolgens worden de monsters geladen en wordt de geprogrammeerde HI-kolomscoutingmethode uitgevoerd om de fractie-monsters van de EIT te verzamelen. Ten slotte wordt de EIT geanalyseerd en worden de optimale HI-kolom en het medium geïdentificeerd op basis van de waargenomen scheidingskenmerken. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een voorkeursmedium voor de HI-kolom aanduiden voor de opgeschaalde zuivering van het eiwit van belang van de onderzoeker via medium-druk vloeistofchromatografie, gebruikmakend van de geautomatiseerde HI-kolomscoutingmogelijkheden van de DUO flow.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals opeenvolgende runs van handmatige kolomchromatografie, is dat automatisering van het proces de variabiliteit vermindert en zeer reproduceerbare resultaten garandeert. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de fysieke complexiteit van moderne vloeistofchromatografiesystemen. Dit kan echter gemakkelijk worden onder de knie gekregen.

Na voldoende oefening zullen Orange Stone en Shelly Anderson, twee studenten uit mijn laboratorium, de procedure demonstreren. Bereid ter start 500 milliliter van de volgende buffers: 200 millimolair natriumfosfaat voor buffer A1, 200 millimolair natriumwaterstoffosfaat voor buffer A2 en 4,8 molair ammoniumsulfaat voor buffer B2; gedeïoniseerd water dient als buffer B1. Ontgas de buffers om optimale chromatografische bedrijfsomstandigheden te waarborgen. De systeemmaximizer zal buffers A1 en A2 mengen om een fosfaatelutiebuffer met een laag zoutgehalte te genereren, en zal buffers B1 en B2 mengen om het ammoniumsulfaat met een hoog zoutgehalte te genereren.

Startbuffer. Bereid 20 milliliter monster ter belading door 10 milliliter cellysaat bevattende het te zuiveren eiwit te mengen met 10 milliliter buffer B twee. De uiteindelijke ammoniumsulfaatconcentratie van de cellysaatmonsteroplossing moet ongeveer 2,4 molar zijn, waardoor deze nagenoeg gelijk is aan de startbuffer.

Filter het mengsel van lysaatbuffer door een spuitfilter van 0,45 micrometer met lage eiwitbinding om vaste deeltjes uit de oplossing te verwijderen. Bewaar het monster op ijs totdat het klaar is om in het systeem te worden geladen. De fysieke opstelling en de leidingen van het chromatografiesysteem vormen een van de meest complexe aspecten van deze procedure.

Stel het duo-flow chromatographiesysteem in volgens het hier getoonde diagram. Zorg dat er voldoende volumes buffer beschikbaar zijn voor het gehele protocol en dat de slangjes ondergedompeld blijven. Sluit de monsterlaadklep en de dynamische monsterloop aan zoals hier geïllustreerd, en verbind de monsterloop met de monsterklepinlaat op positie drie.

Bereid acht identiek formaat paren PEEK-buisjes voor met een buitendiameter van 1/16 inch. Verbind vervolgens de paren met posities één tot en met acht van de twee kolomselectiekleppen. Nadat de lampen van de UV-detector zijn ingeschakeld en is bevestigd dat alle detectoren zijn gekalibreerd, bevestigt u de stroomsplitterklep en de splittercontroller van de fractiecollector zoals hier afgebeeld.

De splitklaap van de fractiecollector op positie twee en de splitcontroller worden offline van het chromatografiewerkstation bediend. Stel de splitpercentage in op 10. Vervang de standaard drophead van de fractiecollector op positie twee door een microplate-drophead.

Spoel de monsterlus en spoel het chromatografiesysteem door. Start vervolgens een handmatige flow van 1 mL/min evolutiebuffer door het systeem. Verbind High Trap HI-kolommen van 1 mL met posities twee tot en met acht van de kolomselectieventielen.

Verwijder de koppeling die de selectiekleppen voor kolompositie twee verbindt. Bevestig de fittingen van de stroomopwaartse kolom aan de duo flow. Laat de elutiebuffer door de fittingen stromen totdat alle lucht is verdreven en er een grote druppel buffer aanwezig is.

Verwijder vervolgens de stop die verbonden is met de kolomingang en breng een grote druppel buffer met een laag zoutgehalte aan op de bovenkant van de kolom. Bevestig de kolom daarna aan de stroomopwaartse koppelingen. Sluit de uitgang aan op de stroomafwaartse kolomkoppelingen en de slangen van de selectieklep.

Stel de tegendruklimiet in op 40 PS.I. Was de kolom met vijf kolomvolumes elutiebuffer bij een stroomsnelheid van 1 ml/min. Was de kolom vervolgens met 10 kolomvolumes startbuffer bij een stroomsnelheid van 1 ml/min.

Zodra de pH- en UV-registraties en de tegendruk zijn gestabiliseerd, schakelt u de kolomselectieventielen handmatig naar positie één en stopt u de bufferstroom. Om een monster te laden, dompelt u de monsterinlaatslang in het monster van 20 milliliter. Schakel vervolgens het monsterloop-laadspoelventiel naar positie één en het monsterlaadventiel naar spoelen.

Activeer de monsterlus-laadpomp, waarbij het monster met een stroomsnelheid van 1 ml per minuut in de pompslangen wordt opgezogen tot het monster net het monsterlaadventiel heeft bereikt. Zet het monsterlaadventiel van purgeren naar laden. Start de monsterlus-laadpomp opnieuw met een stroomsnelheid van 1 ml per minuut totdat er 10 ml monster in de dynamische monsterlus is getrokken via het instellingsvenster in de biologische software.

Selecteer de systeemapparaten die in deze tabel met een asterisk zijn gemarkeerd. Selecteer vervolgens zes HIC-kolommen om het programma te analyseren. Een lineaire dalende zoutgradiënt en een scoutingmethode voor zes kolommen starten handmatig de stroom van de startbuffer bij één milliliter per minuut.

Druk op start op de splitter-controller om direct na het starten van de programmamethode de 90% naar 10% EIT-stroomsplitsing te beginnen. Druk op start op het bedieningspaneel op het scherm van de offline 96-wells plaat fractiecollector. Observeer het real-time display om de verwachte run-parameters te bevestigen. Vergelijk de GFP-specifieke 397 nanometer absorptiecurve met de algemene eiwit- 280 nanometer absorptiecurve om de relatieve scheiding en zuivering te schatten met behulp van de verschillende gescoute HI-media. Aliquots van 5 tot 50 µL uit de 96-wells plaatfracties kunnen worden overgebracht naar een nieuwe plaat en geanalyseerd worden op specifiek eiwitgehalte via ELISA of Western blot en op totaal eiwitgehalte met behulp van SDS-PAGE of een Experian microfluïdisch elektroforesesysteem. Representatieve HIC-zoutgradiëntgeleidbaarheid en kolomdruk van de scouting-runs worden hier getoond.

De verandering in zoutconcentratie, gemeten als het percentage buffer dat uit de lijnen met hoge zoutconcentratie wordt getrokken, is kenmerkend voor de HI-methodologie. Naarmate de zoutconcentratie afneemt, elueren de aan de kolom gebonden eiwitten; de conductiviteit, die overeenkomt met de waargenomen zoutconcentratie, wordt in lijn direct na de quad tech- en UV-detectoren gemeten. Het verschil tussen de zoutgradiënt en de conductiviteitscurves geeft de tijd aan die de buffer nodig heeft om van de bufferinlaat door het systeem naar de conductiviteitsmonitor te reizen.

Gedurende de monsteranalyse blijven de systeemdruk en de pH relatief constant. Deze figuur toont chromatogrammen van opeenvolgende HI-kolomscoutingruns met inline detectie van totaal eiwit. NGFP wordt gerealiseerd door respectievelijk de lichtabsorptie bij 280 nanometer en 397 nanometer te meten.

Het is mogelijk om de relatieve GFP-overvloed en scheiding voor elke scouting-run te benaderen. Door de twee lijnen in deze figuur te vergelijken, werden de kweekbuisjes voor fracties 10, 12, 14, 16 en 18 van de venkel FF scouting-run gevisualiseerd onder omgevings- of fluorescentielicht en ultraviolette lichtbuizen, waarbij zowel van voren als van boven werd gekeken om het karakteristieke GFP-emissiespectrum waar te nemen; GFP wordt duidelijk gedetecteerd in fractie 14. In beide UV-afbeeldingen is het diffuse blauw in het linker UV-paneel licht dat wordt uitgezonden door de UV-lamp.

Deze data na de run komen goed overeen met de inline-detectie van GFP door de absorbentie van het eluaat bij 397 nanometer te meten, wat fractie 14 eveneens identificeert als de fractie die de hoofdpiek van het gezuiverde GFP bevat. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals western blotting, ELISA's, atoomkrachtmicroscopie en biochemische reconstitutie-assays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de zuiverheid en functionele activiteit van het eiwit dat wordt gezuiverd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de noodzaak van handmatige bediening van het dubbele stroomsysteem op verschillende punten in de methode. Voorbeelden hiervan zijn het bijvullen van buffers en het laden van monsters, het controleren op luchtbellen en het naar behoefte in- en uitschakelen van detectielampen. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe u een vloeistofchromatografiesysteem gebruikt voor het geautomatiseerd scouten naar optimale HI-kolommen en media.

Op basis van de inline- en posteranalyse kan een onderzoeker een geschikte kolom selecteren voor een daaropvolgende opschaling van de zuivering, wat eventueel kan worden gecombineerd met andere chromatografische methoden om de zuiverheid en opbrengst van het doeleiwit te verhogen.