Lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen In vivo

Een van de uitdagingen bij het bestuderen van ontwikkeling in de neurowetenschappen is het in vivo vastleggen van dendritische en axonale morfologieën op het niveau van een enkele cel. In het reukstelsel strekken reuksensoneuronen hun axonen uit van het reukeptheel in de neus naar de bulbus olfactorius in de hersenen. Aangezien meerdere reuksensoneuronen richting de bulbus olfactorius projecteren, vormen zij bundels via fasciculatie.

Dit bemoeilijkt de studie van individuele axontrajecten en hun terminale morfologieën. We hebben een methode ontwikkeld om individuele olfactorische sensorische neuronen in vivo te visualiseren door micro-injectie van een GFP-construct dragen lentivirus.

Succesvolle transductie met lentivirus verlicht de gehele lengte van het olfactorische sensorische axon, inclusief de terminale arbor. Naast het visualiseren van individuele olfactorische sensorische neuronen, stelt deze methode ons in staat om de genexpressie van een specifiek gen van belang te manipuleren om de functie ervan in een in vivo context te bestuderen. Deze lentivirusprocedure valt onder biosafety level twee en moet in een laminaire flowkast worden uitgevoerd.

Om een steriele omgeving te behouden, dient alles wat in de laminaire flowkast wordt geplaatst, in de kast te worden besproeid met 70% ethanol. Bereid een waterbad van 37 °C voor en warm dit minimaal 20 minuten voor voordat u gaat injecteren. Vul een plastic opbergzak voor de helft met water, sluit deze af en plaats deze op een lege warmteblokincubator.

Dit geeft de muizen de tijd om te herstellen na de injectie. Vul een container voor biologisch gevaarlijk afval met 10% bleekmiddel om al het materiaal dat aan het virus is blootgesteld te ontsmetten. Bereid voor deze procedure een klein open schaaltje met 70% ethanol en een tweede schaaltje met steriel gedestilleerd water voor.

In een laminaire flowkast gebruiken we een Hamilton-spuit met een capaciteit van 5 µL en een naald van gauge 33. Dit specifieke model maakt het mogelijk om de weerstand van de zuiger aan te passen door aan een spanningsknop bovenop de zuigerkamer te draaien. Deze functie biedt controle over het microinjectievolume om de naald en de spuitkamer te steriliseren.

Aspirer en spuit ethanol herhaaldelijk meerdere keren in en uit de schaal. Spoel de spuitpatroon door meerdere keren steriel water te aspireren en uit te stuiten. Plaats de spuit veilig opzij in de laminaire flowkast.

Plaats alcoholdoekjes in de buurt van het injectiestation. Bereid een injectieplatform voor dat een verhoogd oppervlak biedt om de positionering van de muis te vergemakkelijken. Hiervoor kan een omgekeerde kweekschaal van 10 centimeter worden gebruikt, bedekt met Kim wipes.

Muispups kunnen door middel van hypothermie worden geanestheseerd tot aan de sponingsleeftijd. Knip een vinger uit een rubberen handschoen en plaats de muispup in de uitgesneden vinger. Plaats deze vervolgens vijf minuten op ijs.

De handschoen voorkomt huidverbrandingen die zouden ontstaan door direct huidcontact met het ijs. Test op volledige anesthesie door in de achterpoten en de vier voetjes van de pup te knijpen om er zeker van te zijn dat het dier niet reageert. We zijn nu klaar voor de micro-injectie van het lentivirus. We zullen dit demonstreren bij een neonatale pup.

Indien er gebruik wordt gemaakt van muizen op oudere leeftijd, dient de naald van 33 gauge te worden vervangen door een dikkere naald om het oppervlak van de schedel te kunnen penetreren. Steriliseer het oppervlak van de neus van de muis door deze af te vegen met een alcoholdoekje. Haal de lentivirus-stocks uit de vriezer en laat deze ontdooien op ijs.

We hebben in het laboratorium zelf lentivirus geproduceerd met behulp van gevestigde methoden. Bij de ontwikkeling van deze methode hebben we vastgesteld dat een minimale virale titer van 10⁹ infectieuze eenheden per ml vereist is voor een goede transductiesnelheid. Aspireer 2 µL van de lentivirus-stockoplossing in de gesteriliseerde Hamilton-spuit.

Plaats de muizenpup op de injectietafel. Pak de huid boven op de kop bij de oren vast en trek deze voorzichtig naar achteren. Wij hebben onze flowhood uitgerust met een dissectiescoop.

Om micro-injecties nauwkeurig te kunnen richten, zoekt u op het dorsale schedeloppervlak bij de voorhersenen naar de omtrek van de bulbus olfactorius. Onze doelen voor micro-injecties liggen vlak rond de bulbus olfactorius, maar mogen de bulbus zelf niet omvatten. We geven vier injecties in het reukepitheel van elke pup.

Deze posities, weergegeven met blauwe stippen, vereisen dat de naald in een hoek mediaal gericht wordt ingebracht. De twee extra injecties, weergegeven met groene stippen, zijn versprongen geplaatst, meer mediaal en anterieur ten opzichte van de olfactory bulb. Deze injecties kunnen in een caudale hoek worden uitgevoerd.

De suggesties voor de hoeken van de naald zijn gedaan met het oog op de ventrale positie van het olfactorische epitheel, dat grotendeels onder de bulbus olfactorius ligt. De loodrechte toegang is daarom beperkt. Voer de naald in via de bovenzijde van de neusholte, ongeveer drie millimeter onder het huidoppervlak.

Om het reukepitheel te bereiken. Een ervaren hand zou de afname in weerstand moeten voelen wanneer de luminale ruimte van de neusholte wordt bereikt. Dit gebied moet worden vermeden.

Injecteer via micro-injectie 0,5 µL van de virus-voorraadoplossing per positie. Kies opnieuw twee locaties per zijde, zowel links als rechts, voor in totaal vier injecties van 0,5 µL. Dit betekent dat er per muis twee µL virus nodig zijn tijdens één injectiesessie.

Wees opnieuw voorzichtig om te voorkomen dat de olfactory bulb blot droogt; dep eventuele resterende virusoplossing of bloed weg dat uit de injectieplaats of de neusgaten kan ontsnappen. Gebruik een ethanoldoekje, gooi de doekjes weg in de container met verdunde bleekoplossing en plaats de geïnjecteerde muis onmiddellijk op de waterbed-incubator voor herstel. Decontamineer de naald en spuit door de sterilisatieprocedure te herhalen die tijdens de voorbereiding is uitgevoerd. Geïnjecteerde muizen kunnen 30 minuten na het herstel op de waterbed-incubator terugkeren naar hun kooi.

Deze volledige micro-injectie kan na vier uur opnieuw worden herhaald. Als u het aantal te infecteren olfactorische sensorische neuronen wilt verhogen, kunnen de geïnfecteerde olfactorische sensorische neuronen al na drie dagen over de gehele lengte van de cel worden gevisualiseerd. De dieren worden op het gewenste tijdstip geofferd en geperfuseerd voor observatie.

Om de trajecten en axonterminalen van getransduceerde enkelvoudige olfactorische sensorische neuronen te visualiseren, dissecteren we de bulbus olfactorius en maken we coronale coupes met een dikte van 60 micron met behulp van standaardmethoden. De coupe bevat zo alle cellagen van de bulbus olfactorius, inclusief de axonbundels en axonterminalen van de olfactorische sensorische neuronen, die synapteren in glomerulaire structuren aan het oppervlak van de bulbus, ter voorbereiding op floating immunohistochemie. Er worden seriële coupes van de bulbus olfactorius gemaakt, die gezamenlijk met vijf milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing in een kweekschaal van 10 centimeter worden verzameld.

Breng de drijvende coupes over naar een conisch buisje van 50 milliliter. Zodra de coupes naar de bodem van het buisje zijn gezakt, wordt de fosfaatgebufferde zoutoplossing afgezogen. Let erop dat de coupes niet worden meegezuigd.

Vul uw secties aan met 10 milliliter verse buffer om alle resterende fixeerstof of inbeddingsmateriaal weg te wassen. Pipetteer deze resuspensie onmiddellijk in een conische buis van 15 milliliter, zorg dat alle drijvende secties worden meegenomen, zuig de spoeloplossing af en perforeer de secties met een oplossing van 0,3% Triton X 100 in phosphate buffer saline; plaats dit vervolgens 10 minuten op een schudplatform. Bij kamertemperatuur kunt u vervolgens doorgaan met een standaard immunokleuringsprotocol in dezelfde conische buis; herhaal de vacuüm- en schudstappen naar behoefte voor een vat van deze grootte en behoud een volume van 10 milliliter voor de kleurings- en spoelstappen.

Hier is een lijst van antilichamen die we gebruiken om positief getransduceerde olfactorische sensorische neuronen en de algemene populatie olfactorische sensorische neuronen samen te kleuren. Voor een grondige penetratie van de antilichamen in de 60 micron dikke doorsneden van de bulbus wordt aanbevolen om overnacht te incuberen bij vier graden Celsius. De wasstappen mogen elk niet korter zijn dan 20 minuten.

Spreid elke sectie voorzichtig uit op een objectglas met een penseel en monteer elk glaasje met flora Mount G aangevuld met een chromatiniekleuringsoplossing. Zorg ervoor dat alle luchtbellen uit het montage medium worden verwijderd. Monteer de secties in rijen om de daaropvolgende screeningsstap te vereenvoudigen.

Scan deze lagen van uw immunogekleurde bolsecties op GFP-positieve axonvezels en termini. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop kunnen positief geïnfecteerde zenuwterminals vervolgens worden afgebeeld via confocale microscopie. Het is nuttig om het brandvlak in uw interessegebied te kalibreren met behulp van de DPI- en olfactory marker protein-kanalen.

Deze resultaten tonen een enkele axonvezel en axonterminaal van een olfactorisch sensorisch neuron binnen de glomerulus, waarbij CO met olfactorisch marker-eiwit in rood en vlu twee in grijs zijn weergegeven; geïnfecteerde cellichamen van olfactorische sensorische neuronen en hun dendritische knop kunnen ook worden gevisualiseerd binnen het olfactorische epitheel, indien dit weefsel was opgenomen in de dissectie- en immunokleuringsstappen. Deze confocale projectie biedt ons een zeer gedetailleerde morfologie van het axonale extensiepad en de terminale arborisatie van een enkel olfactorisch sensorisch neuron. Men kan de terugbuiging van de axonvezel richting het glomerulaire doel zien, evenals de details van het vertakkingspatroon binnen het glomerulaire neuropiel.

De lentivirale microinjectiemethode maakt de visualisatie van individuele axonale morfologieën van olfactorische sensorische neuronen mogelijk en faciliteert studies naar de manipulatie van genexpressie; lentivirale transductie resulteert in een stabiele genomische integratie van constructen. Lentivirus infecteert naburige cellen niet transsynaptisch. Visualisatie kan al na drie dagen worden bereikt; het is bevestigd dat dit ten minste drie maanden aanhoudt en het blijft waarschijnlijk gedurende langere perioden behouden.

Olfactorische sensorische neuronen raken niet gemakkelijk geïnfecteerd door nasale infusie van een lentivirusoplossing. Daarom is micro-injectie via het oppervlak vereist in deze procedure. Dat is onze procedure voor lentivirus micro-injectie.

Ik hoop dat u al deze informatie nuttig heeft gevonden bij het verkrijgen van uw eigen enkelcelmorfologieën. Veel succes met uw onderzoek.