Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Het algemene doel van deze procedure is om de genexpressie in het neuronale embryonale centrale zenuwstelsel te wijzigen. Dit wordt bereikt door eerst tijdsgebonden drachtige vrouwtjes te verkrijgen en deze voor te bereiden op de operatie. De uterine hoorns worden vervolgens blootgelegd door een abdominale incisie te maken.

Zodra de embryo's zijn blootgesteld, wordt DNA geïnjecteerd in het laterale ventrikel, het derde ventrikel of de subretinale ruimte. De laatste stap van de procedure is het aanleggen van een elektrische stroom aan het embryo via de baarmoederwand, waarbij de pedelelektroden zo worden georiënteerd dat de positieve pool over de gewenste plaats van transfectie wordt geplaatst. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de proliferatie, migratie en differentiatie van neurale progenitoren in de tline kelon dying kelon en het retina aantonen via immunofluorescentiemicroscopie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de degeneratie van transgene muizen, is dat deze snel is, studies met een hogere doorvoer mogelijk maakt en lagere kosten heeft. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van neurale ontwikkeling, zoals welke genen de neurale progenitorcellen, celproliferatie, cellspecificatie, neuronale differentiatie en celmigratie reguleren. De implicaties van deze techniek kunnen leiden tot een beter begrip van de genetische pathways die ten grondslag liggen aan defecten in de ontwikkeling van het CZS, waarvan vele leiden tot cognitieve beperkingen en gedragsstoornissen bij mensen, naast het nut bij het begrijpen van de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel.

Deze techniek kan ook worden toegepast op andere orgaansystemen, zoals het ontwikkelende perifere zenuwstelsel, het hart en de placenta. Daarnaast kan de methode worden gebruikt om ziektemodellen in muizen en andere modelorganismen, zoals kuikens en xip, te bestuderen. Over het algemeen is de belangrijkste hindernis voor mensen die nieuw zijn met deze techniek de overleving van het embryo; er moet voorzichtig worden gewerkt bij het manipuleren, injecteren en positioneren van de embryo's.

We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we een snelle manier nodig hadden om de genexpressie in het embryonale telencefalon en het netvlies te manipuleren. We hebben deze techniek in ons laboratorium ontwikkeld door de techniek aan te passen die oorspronkelijk werd beschreven door Sal, gepubliceerd in het tijdschrift Developmental Biology in 2001. We hebben daarnaast samengewerkt met een crash lab om dit protocol ook vast te stellen in het ontwikkelende dilon.

De visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de injectie- en elektroporatiestappen moeilijk aan te leren zijn omdat ze een zeer zorgvuldige manipulatie van de embryo's vereisen en de injectieplaatsen soms zeer klein kunnen zijn. Bijvoorbeeld de subretinale ruimte. De procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Rajiv, een postdoc uit het laboratorium van Sherman. Begin met het reinigen en steriliseren van alle chirurgische instrumenten. Vul vervolgens spuiten met zoutoplossing en lactaat-Ringer-oplossing en plaats deze op een warmteplateau om ze op te warmen in het chirurgische gebied.

Steriliseer een warmtepad met 70% ethanol en bedek het vervolgens met een gesteriliseerd pluisvrij gaasje. Stel het warmtepad in op 37 °C. Plaats het dier in een kleine anesthesiekamer en anestheseer het door 5% isofluraan met zuurstof bij één liter per minuut via een verdampler toe te dienen.

Zorg ervoor dat de isofluoraan-uitlaatgassen worden opgevangen met een afzuigingssysteem. Zodra de ademhaling van het dier diep en regelmatig is, wordt het uit de kamer gehaald. Controleer dit middels de teenknijp- en oogknipperreflex.

Om volledige anesthesie te waarborgen, wordt het geanestheseerde dier op de buik geplaatst en wordt een beademingsbuis gebruikt om tijdens de operatie 2,25% isofluraan toe te dienen. Injecteer buprenorfine in een concentratie van 0,1 mg/kg lichaamsgewicht subcutaan in de nek.

Blijf de ademhaling van het dier monitoren en pas indien nodig de toevoer van isofluoraan aan. Plak vervolgens een tape over de borst van het geanestheseerde dier en controleer opnieuw op een terugtrekkingsreactie door de achterpoot met stompe pincetten samen te knijpen. Breng met een steriel wattenstaafje een dikke laag depilatiecrème aan op de buik, waarbij u er zeker van bent dat de ondervacht volledig is bedekt.

Laat de crème ongeveer drie minuten inwerken en controleer tussentijds of het haar is verwijderd. Maak met een steriel wattenstaafje een steriel gaasje nat met steriel water en veeg het haar van de buik af. Steriliseer vervolgens de incisielocatie met chloorhexidine en extra water.

Droog de buik af met schoon steriel gaas. Herhaal deze stap met 70% ethanol met behulp van vers gesteriliseerd katoengas. Bereid de operatie voor door chirurgische kleding aan te trekken om de uterine hoorns bloot te leggen.

Lokaliseer eerst de linea alba als de vage lijn onder de huid in de middellijn. Trek met een pincet de huid weg van de buikwand en maak met huidenscharen en gebogen pincetten en scharen een kleine rechte incisie vanaf de middenbuik naar beneden. Herhaal dit proces bij het peritoneum. Pak het peritoneum vast met het pincet.

Trek het weefsel opzij en maak vervolgens een incisie die net groot genoeg is om de uterus erdoorheen te trekken. Plaats steriel gaas met een kleine verticale sleuven over de incisie en bevochtig dit met warme steriele zoutoplossing. Schuif daarna de pincet in de incisie en lokaliseer de uterus terwijl de incisie met de pincet open wordt gehouden.

Pak de uterus vast tussen de eerste en tweede zichtbare embryo's en trek beide zijden van de uterushoorns op het gaas. Tel het aantal embryo's en noteer eventuele resorpties of embryo's met een geringe lichaamsgrootte. Om het juiste aantal DNA-injecties voor te bereiden, bevochtig de uterushoorns met zoutoplossing en plaats één uterushoorn voorzichtig terug in de buikholte.

Om de chirurgische naalden te laden, gebruikt u een micropipet met een mondstuk om 10 µL van een endotoxinevrije DNA-oplossing van 3 mg/mL met methylgroen-kleurstof op te zuigen en het DNA in een chirurgische naald te brengen. Bevestig de eerste gevulde naald aan de micromanipulator.

Plaats de injector tegen het embryo aan, beginnend bij het embryo dat het dichtst bij het ovarium ligt. Gebruik ronde pincetten om het embryo voorzichtig binnen de decidua te draaien, zodat het met de voorzijde naar voren is gepositioneerd, waardoor injecties in een ROS-rol in cordale richting kunnen worden uitgevoerd. Gebruik een glasvezellichtbron om de middellijn van het embryonale brein te identificeren.

Let op de geflankeerde grote zijventrikels in de rostrale regio's. Houd het embryo op zijn plaats met een gebogen pincet en positioneer de gevulde chirurgische naald boven de uterus, zodanig dat de insteekhoek in de hersenen ongeveer 45 graden is. Draai met een snelle en gestage beweging aan de knop van de micromanipulator om de naaldpunt door de baarmoederwand en in het zijventrikel van de embryonale hersenen in te brengen.

Druk vervolgens op het voetpedaal van de micro-injector. Voor het injecteren van de DNA-oplossing kan een succesvolle injectie eenvoudig worden gevisualiseerd door de verspreiding van de methylgroene kleurstof door de ventricels van het embryonale brein. Nu het DNA is geïnjecteerd, trekt u de naald langzaam terug om deze te verwijderen zonder breuk te veroorzaken.

Plaats het geïnjecteerde embryo op het steriele gaas en maak het grondig nat met warme zoutoplossing. Grijp de uterus vast met de positieve pool van de pedelelektrode geplaatst over de gewenste plek voor transfectie. Dien vervolgens vijf vierkante elektrische pulsen van 40 tot 50 volt en 50 milliseconden toe met een frequentie van één puls per seconde.

Bedek het geïnjecteerde en geëlektroporeerde embryo met beschermend nat gaas en ga vervolgens over tot het injecteren van het volgende embryo. Wanneer alle gewenste embryo's in de uterine horn zijn geïnjecteerd en geëlektroporeerd, wordt deze voorzichtig terug in de lichaamsholte geduwd. Verwijder de tweede uterine horn om te beginnen met de injectie en elektroporatie van de overige embryo's.

Zodra alle embryo's terug in de baarmoeder zijn geplaatst, voegt u twee tot drie milliliters warme zoutoplossing toe aan de buikholte en verwijdert u vervolgens het gaas uit het abdomen om de zijkanten van het peritoneum bloot te leggen. Gebruik zwart gevlochten zijden hechtdraad om het peritoneum te hechten door de draad te verankeren in het peritoneum dichtstbij het sternum en vervolgens weg van het ankerpunt te hechten. Zorg ervoor dat alle hechtingen strak zitten en dat er geen onderliggende organen of huid in het peritoneum zijn meegehecht.

Knip de resterende hechtlijn af en gooi deze weg. Trek de huid met een pincet over de hechtlijn dicht met behulp van huidnietjes. Zet de nietjes in de huid, waarbij u er op let dat u de onderliggende hechtlijn niet vastniet of de huid te strak trekt.

Zorg er na voltooiing voor dat de nietjes stevig vastzitten door ze hier voorzichtig met het hechtinstrument samen te drukken, A-P-C-I-G twee expressievectoren die de expressie van GFP aansturen zijn geëlectroporeerd in de ontwikkelende neocortex op E 12. Naarmate de neocorticale ontwikkeling vordert, differentiëren de apicale progenitorcellen in ofwel secundaire basale progenitorcellen of postmitotische neuronen en blijven zij GFP tot expressie brengen. Deze neurale cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd op de expressie van typische markers voor het neurale subtype, weergegeven in rood.

In dit ventrale zicht van een voorbrein van een embryo dat is ge-electroporeerd op E 12 en is gedissekeerd op E 14, wordt de ge-electroporeerde plek aangegeven door de groene epifluorescentie op E 14. GFP-expressie is zichtbaar in de thalamus, prethalamus en hypothalamus, wat aangeeft dat de doelgebieden succesvol zijn getransfecteerd. De gestreepte box markeert de locatie van de doorsnede door de ventriculaire zone.

Een nadere beschouwing van de ventriculaire zone toont de migratie van GFP-cellen vanuit de ventriculaire zone naar de mantelaanleg. Waar de hypothalamuskernen zich vormen, wordt ook de embryonale retina gemakkelijk geëlektroporeerd, zoals te zien is in deze coronale sectie door een E 16.5 embryo dat op E 15.5 is geëlektroporeerd met PCIC. Hier is de accumulatie van mCherry-positieve cellen specifiek voor de buitenste neuroblastlaag en wordt deze niet gezien in Brn3b-positieve retinale ganglioncellen in de ganglioncellaag. Zodra de techniek onder controle is, kan deze in 30 minuten worden uitgevoerd, mits er geen onvoorziene complicaties optreden.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om juiste steriele technieken toe te passen, een vaste hand te hebben bij het manipuleren van de embryo's en alle benodigde materialen klaar te hebben voordat het drachtige vrouwtje onder narcose wordt gebracht. Na deze procedure kunnen de elektro-gebraided embryo's tot volwassenheid worden gelaten, waarna andere methoden zoals gedragsmatige en functionele assays kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe de manipulatie van bepaalde genen in het embryo de neuronale functie bij de volwassene beïnvloedt. Sinds de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel (CZS) om genfuncties in vivo bij muizen te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in het introduceren van vreemd DNA in de embryonale neurale buis. In het bijzonder laten we zien hoe u een drachtige vrouwtje voorbereidt op de operatie. We tonen het blootleggen van de uterus, het injecteren van DNA en het elektrocuteren van het embryo.

Vergeet niet dat werken met isofluor hazardous kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals een scavengesysteem moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.