Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via In utero Elektroporatie

Het algemene doel van deze procedure is om plasma-DNA te transfecteren in de hypothalamus van muisembryo's die zich in utero ontwikkelen om de functie van een gen van belang te activeren of onderdrukken. Dit wordt bereikt door eerst de zwangere muis te anesthetiseren en de baarmoeder bloot te leggen door middel van een laparotomie. De tweede stap is om de DNA-oplossing in de derde ventrikel van de embryonale hersenen te injecteren.

Vervolgens wordt de positieve elektrode geplaatst binnen de baarmoeder tussen de placenta en het embryonale hoofd. De negatieve elektrode wordt op het uiterlijke baarmoederslijmvlies geplaatst en er worden elektrische pulsen toegepast. De laatste stap is om de getransfecteerde embryonale hersenen zes dagen later te verwijderen.

Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de fenotypische veranderingen van de getransfecteerde cellen, aantal, vorm, positie, markerexpressie, enzovoort te analyseren. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals virale transfectie zijn ten eerste dat er geen speciale voorzorgsmaatregelen nodig zijn, en ten tweede dat targeting van een specifiek gebied mogelijk is. En ten derde, met Ute elektroporering is het screenen van kandidaatgenen sneller.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het injecteren van de DNA-oplossing in de derde ventrikel en het correct positioneren van de naaldelektrode geavanceerde handmatige vaardigheid en enige ervaring vereisen. Deze methode kan helpen om vragen te beantwoorden op het gebied van hypothalamusontwikkeling, met name die relevant zijn voor celmigratie, evenals hoe individuele regio's en nucle genetisch gespecificeerd zijn. Begin deze procedure door enkele glazen micropijpen van goede kwaliteit te trekken, omdat ze essentieel zijn om de aanvankelijke hoge abortussnelheid te verminderen als gevolg van verlies van vruchtwater.

Om DNA voor te bereiden, lost u het gezuiverde endotoxinevrije plasma-DNA op in PBS met 0,1% fast green tot een eindconcentratie van een tot twee microgram per microliter. De fast green maakt de geïnjecteerde oplossing zichtbaar in de ventrikel van de embryonale hersenen. Laad vervolgens 10 microliter van de DNA-oplossing in de glazen micropijp.

Verbind vervolgens de glazen micropijp met het injectiesysteem of een mondpijp. In deze stap bereidt u de operatietafel voor met een verwarmingskussen en de chirurgische instrumenten. Zet de koude lichtbronnen aan om de visualisatie van de embryo's te vergemakkelijken. Desinfecteer vervolgens de chirurgische gereedschappen met behulp van een glazenkraalsterilisator.

Vervolgens verdooft u een zwangere muis met isofluorine. Nadat de muis verdoofd is, brengt u zalf aan op haar ogen om uitdroging te voorkomen. Breng vervolgens de masker op haar gezicht aan om de anesthesie continu te handhaven.

Plaats nu de muis op een verwarmingskussen met haar buik omhoog. Bevestig haar lichaam op zijn plaats door haar vier ledematen met tape te fixeren. Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd is door in haar staart te knijpen om reflux te veroorzaken.

Scheer vervolgens het buikoppervlak en desinfecteer het met jodiumoplossing. Maak een longitudinale incisie van ongeveer een tot anderhalve centimeter lang op de buikhuid. Snijd daarna het buikvlies door.

Plaats vervolgens katoengaas rond de incisie. Spoel het gaas af met PBS. Leg een baarmoederhoorn bloot door het voorzichtig met stompe pincetten eruit te trekken.

Vermijd het strak trekken van het myometrium of de baarmoeder. Hoge druk in de baarmoeder verhoogt de kans op embryovloeistofverlies bij injectie, wat kan resulteren in abortus. Plaats vervolgens de baarmoederhoorn op een met PBS gespoeld gaas en spoel het om de paar minuten met PBS om het vochtig te houden.

Houd nu, onder de microscoop, de baarmoeder zo vast dat de hersenventrikels zichtbaar zijn. Herpositioneer het embryo dat in een ongunstige positie ligt niet uitgebreid. Dit verhoogt alleen de kans op abortus.

Kijk van bovenaf naar het hoofd van het embryo om de opening te lokaliseren waar de kloof tussen de linker en rechter corticale hemisphären is. De hemisphären zijn gemakkelijk te onderscheiden, en de laterale ventrikels erin kunnen meestal worden waargenomen als iets donkerdere vormen. Als een embryo perfect georiënteerd wordt gevonden voor DNA-injectie, is het mogelijk om de baarmoederwand te doorboren en direct de derde ventrikel binnen te gaan.

Houd de glazen micropijp met het eerder voorbereide DNA onder een hoek van 45 graden tegen de baarmoederwand en prik het op het rostrale uiteinde van de interhemisferische kloof, tot een diepte van ongeveer een millimeter doordringend. Op deze manier zal de punt van de glazen micropijp de derde ventrikel van de hersenen binnengaan en niet de laterale ventrikel. Injecteer vervolgens ongeveer een microliter DNA-oplossing in de derde ventrikel, groene vloeistof zal de ventrikel vullen bij een goede injectie, herhaal dezelfde procedure met alle embryo's van dezelfde baarmoederhoorn.

Dit geeft wat tijd om de DNA-oplossing gelijkmatig te mengen met het ventrikelvocht en het hele neuro-epitheel te bereiken. Schakel nu de elektro perter in en pas de instellingen aan volgens de embryonale leeftijd. Gebruik de roestvrijstalen naaldeletrode als positieve pool en de ronde platte elektrode als negatieve pool, selecteer de embryo's met de dorsale kant omhoog voor elektroporering.

Prikt vervolgens de baarmoederwand naast het hoofd van het embryo door de punt van de naaldeletrode er doorheen te steken en naar beneden te duwen tussen de vruchtzak en de placenta. Gebruik vervolgens de wijsvinger van de andere hand als duwblokken. Ongeveer vijf millimeter van de punt van de elektrode moet zich tussen de vruchtzak en de baarmoederwand op ongeveer het niveau van de middenhersenen bevinden.

Aangezien dit de targeting-elektrode is, zal de positie ervan bepalen welk deel van het hypothalamus neuro-epitheel het meest waarschijnlijk wordt getransfecteerd. Positioneer vervolgens de ronde platte elektrode buiten de baarmoederwand aan de andere kant van het hoofd van het embryo met de andere hand. Knijp vervolgens voorzichtig het embryo tussen de