Visualisatie van Recombinant DNA en eiwit complexen met behulp van Atomic Force Microscopy

Het algemene doel van deze procedure is om biomoleculen zoals DNA en eiwitten in waterige buffers in real-time af te beelden met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst de te beeldvormen biomoleculen voor te bereiden. Vervolgens wordt de atoomkrachtmicroscoop ingesteld en wordt een FM-cantilever-probe gepositioneerd.

Vervolgens worden het oppervlak van het monster en de biomoleculen van belang afgebeeld en geanalyseerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de algemene grootte, hoeveelheid en organisatie van DNA en eiwitten en heterogene biomoleculaire complexen in gebufferde condities laten zien via atoomkrachtmicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van moleculaire chaperonnes, zoals wat de STO-geometrie is van het complex van chaperonnes en co-chaperonnes met een cliënt.

Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig, aangezien de stappen voor de voorbereiding van de AFM- en Kent-lever-probe moeilijk te leren kunnen zijn aan de hand van gedrukte instructies, grotendeels vanwege de complexiteit die gepaard gaat met de fysieke manipulatie ervan. De procedure zal worden gedemonstreerd door Morgan Shannon en John Gertz, twee studenten uit mijn laboratorium. Begin met het isoleren van de eiwit- of DNA-moleculen die afgebeeld moeten worden en suspendeer deze in een waterige buffer. Nadat de zuiverheid van het monster is bevestigd, wordt dit op ijs geïncubeerd in een AFM-absorptiebuffer om de hechting van het monster aan mica te bevorderen.

Gebruik voor eiwitmonsters een 10 millimolair HEPES-buffer. Voor DNA is een magnesiumbevattende buffer bestaande uit 10 millimolair tris, pH 7,5, 10 millimolair natriumchloride en twee millimolair magnesiumchloride geschikt voor het monteren van de AFM-probe. Plaats de probehouder van de vloeistofcel op het bijbehorende dockingstation voor de installatie van de cantilever.

Lokaliseer de lange, dikke cantilever van de scherpe nitride leverprobe die voor de beeldvorming zal worden gebruikt. Breng deze voorzichtig over naar de probehouder van de vloeistofcel, waarbij u erop let dat de tip rechtop blijft staan. Controleer vervolgens de cantilever onder een lichtmicroscoop om te bevestigen dat deze intact is en correct in de probehouder van de vloeistofcel is geplaatst.

Verwijder vervolgens voorzichtig de a FM-kop uit de zwaluwstaartbevestiging van het instrument door de klemvijs van de neurale kop aan te draaien. Keer de a FM-kop om en druk de houder van de vloeistofcelprobe stevig op de vier pinnen aan de basis van de a FM-kop. Plaats tot slot de a FM-kop voorzichtig terug in de zwaluwstaartbevestiging van het instrument.

Om de FM verder voor te bereiden voordat de monsters worden afgebeeld, draait u aan de knoppen van de geïntegreerde lichtmicroscoop om de cantilever-tip te lokaliseren; gebruik de op- en neer-pijlen van de optiekcontroller in de software om de cantilever-tip in focus te brengen. Gebruik de knoppen voor de laserinstelling om de laser op de cantilever-tip uit te lijnen. Dit is een van de technisch meest uitdagende stappen in het protocol; de positionering gebeurt handmatig en vereist een precieze afstelling van de knoppen.

Zorgvuldige monitoring van de laser in de reflectiespot en de illuminatiespot vergroot de kans op een succesvolle uitlijning. Pas vervolgens de knoppen van de fotodetector op de AFM-kop aan om de fotodetector te centreren. Plaats een vers gekliefd vel mica, bevestigd aan een metalen AFM-monsterdisc, op de gemagnetiseerde monsterhouder bovenop de AFM-houderplaat.

Draai de FM-houderplaat zodat de monsterdisk is gepositioneerd voor de initiële beeldvorming. Gebruik de focusoppervlaktebediening van de instrumentsoftware om de FM-kop naar beneden te bewegen richting het oppervlak van de MICA-monsterdisk. Selecteer het tune-pictogram in de instrumentsoftware en stem de cantilever af totdat duidelijke kenmerken op het MICA-oppervlak of de tipreflectie in focus zijn.

De resonantiefrequentie van de aanbevolen MSNL- of SNL-probes ligt tussen 20 en 60 kilohertz. Selecteer een peak offset van 5% om het MICA-monster af te beelden. Breng de probe eerst in contact met het MICA-oppervlak, stel de initiële scanmaat in op 10 micrometers en de scansnelheid op één hertz.

Leg volledige scanbeelden vast van het veld van 10 micrometer. Verklein vervolgens de scanmaat naar 5 en 0,5 micrometer en leg van elk veld volledige beelden vast. Koppel de probe los door eenmaal op het icoon voor ontkoppelen in de software van het instrument te klikken.

Om de biomoleculen van belang te beelden, mengt u vijf µL van het voorbereide monster met 45 µL verse absorptiebuffer. Voeg voorzichtig 50 µL van de oplossing die 0,5 µg/mL biomoleculen bevat direct toe aan het oppervlak van de MICU. Wacht vijf minuten zodat de biomoleculen in het monster zich aan het Micah-oppervlak kunnen hechten.

Pipette vervolgens nog eens 50 tot 100 µL absorptiebuffer in de houder van de vloeistofcelprobe. Pas de fotodetector aan en richt de laser indien nodig opnieuw uit op de cantilever, waarbij u er zorgvuldig op let dat u de probe, een FM-kop of de MICA niet met de pipetpunt aanraakt. Gebruik vervolgens de software van het instrument om de probe opnieuw te activeren.

Vergroot de scanmaat om regio's van belang te identificeren. Zodra de beeldvorming is voltooid, selecteert u meerdere keren het terugtrek-icoon in de software van het instrument om de probe los te koppelen. Spoel tot slot de probehouder van de vloeistofcel en de monsterdisk grondig af met gedestilleerd water.

Probeer het vervolgens met perslucht. Een voorbeeld van een AFM-afbeelding wordt hier getoond. Het mica-substraat biedt een moleculair vlak oppervlak waaraan DNA en eiwitten kunnen adsorberen.

Het afbeelden van MICA vóór de biomolecuulsamples dient als negatieve controle en voor een beoordeling van de beeldruis. Het biedt bovendien de zekerheid dat de cantilever correct is afgesteld en dat de daaropvolgende beeldvorming van het sample succesvol zal zijn. Dubbelstrengs plasma-DNA, vermoedelijk supercoiled, is gemakkelijk te identificeren aan het asymmetrische uiterlijk en de uniforme afzetting op het voorheen onopvallende Micah-substraat.

Proteïnecomplexen met verschillende partikelgroottes zijn eveneens uniek te onderscheiden van het Micah-substraat. Verschillen in partikelgrootte duiden op heterogeniteit van het monster en kunnen nuttig zijn voor het benaderen van de proteïnestoichiometrie, de geometrie van het complex of de biochemische activiteit. De algemene diagonale vorm en consistente oriëntatie van de waargenomen proteïnepartikels.

Hier is een beeldartifact, aangezien eiwitten naar verwachting in willekeurige richting op het Micah-substraat georiënteerd zouden zijn. Mogelijke oorzaken van het waargenomen artifact zijn een fysieke afwijking van de tip of FM-imaging bij een te hoge scansnelheid, terwijl tipconvolutie absolute lengtemetingen in de x- en y-as verhindert; hoogtemetingen in de z-as en relatieve x- en y-metingen kunnen niettemin nuttig zijn voor het schatten van de biofysische eigenschappen van de afgebeelde biomoleculen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de cantilever nauwkeurig af te stemmen en de fotodetector uit te lijnen volgens deze basis FM-procedure.

Andere stappen, waaronder het gebruik van een vloeistofcel voor bufferuitwisseling, kunnen worden toegevoegd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het vermogen van moleculaire chaperones om de vrijgave van steroidreceptoren uit hun DNA-responselementen te beïnvloeden. Na het bekijken van deze video zou u een beter inzicht moeten hebben in het afbeelden van DNA-proteïnen en biomoleculaire complexen met behulp van atoomkrachtmicroscopie onder gebufferde omstandigheden.