Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Het algemene doel van het volgende experiment is om de elastische modulus van levende cellen te meten met behulp van een atoomkrachtmicroscoop. Dit wordt bereikt door eerst een FM-krachtspectroscopiemeting uit te voeren op verschillende locaties op de cel. Als tweede stap wordt elke gedwongen afstandscurve geanalyseerd om het punt te bepalen waarop de A FM-tip voor het eerst contact maakt met de cel.

Vervolgens, beginnend bij het contactpunt, worden de eerste 200 tot 300 nanometer indrukgevingsgegevens aangepast aan het hertz-model. Om de elastische modulus te extraheren, leveren de resultaten een 2D-kaart van de celstijfheid op verkregen door de krachtmappingmodus te gebruiken waarbij elk pixel een enkele gedwongen afstandscurve vertegenwoordigt. Het uitvoeren van de procedure zal worden gedaan door Guen Thomas, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Om deze procedure te beginnen, maakt u de cantileverhouder schoon met 70% ethanol en laat deze drogen.

Laad vervolgens een bru DNP 10 cantilever in de A FM volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens kalibreer de inverse optische hefboomgevoeligheid. Deze parameter beschrijft de hoeveelheid fotodioderespons in volt per nanometer van de cantileverafbuiging.

Om dit te bereiken, laadt u eerst een schone glazen plaat op de monsterstandaard. Installeer de a FM-kop en pas de laserstraal en uitlijning aan volgens de instructies van de fabrikant. Eenmaal uitgelijnd, zet de A FM-tip op de glazen plaat met de P acht O teruggetrokken.

Lijn de spiegel opnieuw uit naar een fotodiode-aflezing van min twee volt. Voer vervolgens een krachtspectroscopiemeting uit met een maximale fotodioderespons of triggerpunt van positief twee volt. Nadat de gegevensverzameling voltooid is, zoom in op het vaste contactgebied van de krachtcurve en voer een lineaire aanpassing uit voor dit gebied.

Om de helling in volt per nanometer te vinden, stelt u de spiegeluitlijning vervolgens terug naar een vrije afbuiging van nul volt. Vervolgens kalibreert u de veerconstante van de cantilever met behulp van de thermische afstemmingsmethode beschreven door Levy en Malam. Om te beginnen, heft u de scanner op van de monsterstandaard zodat er geen interacties zijn tussen de tip en het monster.

Vervolgens vangt u de thermische gegevens op door de thermische trilling van de cantileverbalk op te nemen. De A FM-software analyseert een vermogensspectrum van zo'n thermische trilling en geeft het weer in een datavenster. Voer vervolgens een aanpassing uit op het datasegment gecentreerd op de laagste frequentie, ook bekend als de fundamentele resonantiepiek om de veerconstante te bepalen.

Om de a FM voor te bereiden op de kweekplaten, installeert u een schotelverwarmingsaccessoire op de a FM-standaard en stelt u de temperatuur in op 37 graden Celsius. Wacht 20 minuten tot het systeem een stabiel thermisch evenwicht heeft bereikt. Eenmaal voorverwarmd, plaatst u een kweekschotel op de a FM-standaard en bevestigt u deze met behulp van de klem die bij de schotelverwarming wordt geleverd voor metingen langer dan 30 minuten, koolstofdioxide onafhankelijk medium moet worden gebruikt om het normale kweekmedium te vervangen.

Breng vervolgens een kleine druppel kweekmedium van 37 graden Celsius aan op de tip van de A FM-cantilever en laat de a FM-kop zakken tot de tip net ondergedompeld is in vloeistof. Gebruik een CCD-camera met bovenuitzicht om de laserstraal op de cantilever opnieuw uit te lijnen. De uitlijning in vloeistof zal anders zijn dan in de lucht vanwege de verandering in de brekingsindex van het medium.

Eenmaal uitgelijnd, zet de A FM-tip op een celvrije zone van de kweekschotel en voer de kalibratie van de inverse optische hefboomgevoeligheid in de vloeistofomgeving uit. Om mechanische eigenschapsmetingen van cellen te beginnen, plaatst u de cantilevertip boven het perle-ooggebied van een cel met behulp van een optische microscoop. Nauwkeurige aanpassingen van de cantileverpositie worden bereikt door offsets toe te passen op de X- en Y-scanners.

Schakel vervolgens de a FM in de vier-spectroscopiemodus en stel de indruksnelheid in op vijf micrometer per seconde, wat laag genoeg is om hydrodynamische effecten te voorkomen. Stel vervolgens het triggerpunt van de uitwijking in op twee nanonewton. Om schade aan de cellen te voorkomen, pas deze waarde aan volgens de stijfheid van het monster.

Selecteer bovendien de relatieve triggeroptie, die corrigeert voor eventuele drift in het uitwijkingssignaal. Stel vervolgens de krachtafstand in op vijf micrometer om ervoor te zorgen dat de tip volledig loskomt van de cel tussen krachtmetingen. Verzamel drie krachtcurven op verschillende locaties in de kernregio van minstens 30 cellen voor elke conditie.

Hoewel het voordelig is om meerdere curven op elke cel te nemen. Voor betrouwbare statistische gegevens kan het nemen van te veel leiden tot veranderingen in de celstijfheid tot stress van de A FM-sonde. Karakteriseer verder de verdeling van mechanische eigenschappen door een enkele cel met behulp van de krachtmappingmodus.

In de krachtmappingmodus, stelt u de scangrootte in op 30 micrometer de resolutie op 32 bij 32, en de indrukparameters zijn dezelfde als die geselecteerd voor enkele krachtcurven. De A FM neemt vervolgens enkele krachtcurven op elk pixel in het monsterstuk en biedt een stijfheidskaart van het hele gebied. Analyseer vervolgens de opgenomen krachtcurven met behulp van MATLAB om de celstijfheid te berekenen.

Begin met het adopteren van een algoritme dat voor het eerst is gepubliceerd door Lynette Al, dat zowel een lineaire fit als hertz-fit berekent van elk punt met behulp van matlab. Bereken de relatieve RMS-fout van beide fits en som deze waarden op elk punt. Het punt dat het minimale totale aanpassingsfout bereikt, wordt geselecteerd als het initiële contactpunt. Het lokaliseren van dit punt is cruciaal voor nauwkeurige meting van de young's modulus van de cel.

Bereken vervolgens de monsterdeformatie delta. Gebruik de volgende vergelijkingen waarbij de vervorming gelijk is aan nul vóór celcontact waar Z kleiner is dan Z nul en gelijk is aan het verschil tussen de cantileverafbuiging D en de totale afstand Z voorbij het contactpunt. Bereken vervolgens