Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van een in vivo menselijk vasculair netwerk. Dit wordt bereikt door eerst menselijke endotheliale kolonievormende cellen afgeleid van bloed en menselijke mesenchymale stamcellen afgeleid van beenmerg te kweken. Beide celtypen worden vervolgens gemengd in een gel op basis van collageen, die subcutaan in een immuundeficiënte muis wordt geïnjecteerd.

Zeven dagen later wordt het implantaat geoogst en geëvalueerd op de vorming van een menselijk vasculair netwerk. Uiteindelijk kan de aanwezigheid van mensspecifieke microvaten in de implantaten worden geverifieerd via histologie en immunohistochemie. Het belangrijkste voordeel van deze technologie ten opzichte van een traditionele methode, zoals de chirurgische implantatie van een construct, is dat het eenvoudig uit te voeren is en geen chirurgie vereist.

Begin met het ontdooien van één vial E CFC's en verdun de cellen onmiddellijk in een kegelvormige buis van 15 milliliter met 10 milliliter DMEM. Centrifugeer de celsuspensie bij 1200 RPM gedurende vijf minuten en resuspendeer de celpellet in 10 milliliter verwarmd EGM two-medium. Breng de cellen vervolgens over naar een weefkweekplaat van 100 millimeter die is gecoat met 1% gelatine en incubeer de cellen overnight in een bevochtigde incubator.

De volgende ochtend het medium en alle ongebonden cellen voorzichtig aspireren. Voed de gebonden cellen vervolgens met 10 milliliters vers E GM two medium. Herhaal dit proces gedurende de volgende paar dagen totdat er een confluente monolaag is gevormd.

Was de cellen vervolgens met 10 milliliters PBS. Vervang de PBS door twee milliliters tripsin EDTA en plaats de plaat gedurende vijf minuten terug in de incubator. Tik na vijf minuten voorzichtig tegen de plaat en controleer onder een microscoop of de cellen zijn losgekomen.

Indien dit niet het geval is, herhaal dan de korte incubaties met voorzichtig schudden. Zodra de cellen volledig zijn losgekomen, voeg acht milliliter EGM two medium toe aan de cellen en breng de cellen over naar een 15 milliliter conische buis. Tel de cellen en centrifugeer deze bij 1200 RPM gedurende vijf minuten.

Zaai de cellen nu uit op weefselkweekplaten die zijn gecoat met 1% gelatine bij een zaaidichtheid van 5, 000 cellen per vierkante centimeter. Incubeer de cellen in EGM two medium en ververs het medium elke twee tot drie dagen met EGM two medium. Herhaal deze procedure voor opeenvolgende passages tussen passage vier en acht.

De E CFC's zullen klaar zijn voor gebruik. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor het opkweken van MSC's. Vervang simpelweg E GM two medium door M-S-C-G-M medium.

Gebruik een ongecoate kweekplaat. Begin met subcultiveren bij 80% confluentie en subcultiveer met een zaaidichtheid van 10.000 cellen per vierkante centimeter. Voor dit experiment zijn 800.000 E CFCs en 1.200.000 MSCs per implantaat vereist.

Over het algemeen worden vijf implantaten gelijktijdig voorbereid. Begin met het aspireren van het celmedium uit de kweekplaten en was elke plaat met cellen met 10 milliliters PBS. Vervang de PBS door twee milliliters trypsine EDTA en incubeer de platen onder zacht schudden.

Controleer de cellen elke twee tot vijf minuten onder een microscoop totdat alle cellen zijn losgekomen. Voeg vervolgens 8 mL DMEM toe en verzamel de celoplossing. Tel de cellen in een conische buis van 15 mL en breng voldoende cellen voor vijf implantaten over naar een enkele conische buis van 15 mL.

Centrifuge de cellen vervolgens gedurende vijf minuten bij 1200 RPM en verwijder het supernatant. Bereid voorzichtig een mengsel van fibrinogeen en collageen-fibronectine op ijs voor. Resuspendeer de celpellet daarna zeer voorzichtig in het ijskoude mengsel.

Laad de celsuspensie in een spuit van één milliliter terwijl de vorming van luchtbellen wordt vermeden, en bevestig een afgedekte naald van 26 gauge. Bewaar de gevulde spuit op ijs totdat het celmengsel wordt geïnjecteerd. Anestheseer vier zes weken oude athyme nude immunodeficiënte muizen met behulp van een ISO-fluorchamber.

Zodra de muizen zijn geanestheseerd en niet meer reageren op een knijpreflex in de teen, worden de injecties bij elke muis uitgevoerd. Gebruik een naald van 30 gauge om 50 µl thrombine-oplossingen subcutaan in de bovenste dorsale regio te injecteren. Injecteer op dezelfde locatie 200 µl van het celmengsel.

Met een naald van 26 gauge zullen de geïnjecteerde macromoleculen geleren en een kleine maar merkbare bult onder de huid vormen. Plaats de muizen na de injectie op een laag gaas voor comfort en warmte. Observeer ze totdat ze weer mobiel zijn.

Houd de algemene gezondheid van het dier gedurende de volgende drie dagen dagelijks in de gaten. Euthanaseer de muizen één week na de injecties met koolstofdioxide en verwijder de gelplug chirurgisch. Fotografeer de gelpluggen na extractie naast een liniaal, plaats elke gelplug vervolgens in een histologische cassette en dompel deze gedurende de nacht bij kamertemperatuur onder in 10% neutraal gebufferde formaline.

Was de volgende dag het 10% neutraal gebufferde formaline af met gedestilleerd water. Bewaar de cassettes in PBS bij vier graden Celsius totdat ze worden onderworpen aan histologische evaluatie. Maak coupes van zeven micron van het in paraffine ingebedde implantaat.

Kwantificeer vervolgens de dichtheid van de microvaten in het middelste gedeelte van de implantaten. Bepaal met behulp van een H&E-kleuring het aantal vaten per vierkante millimeter om de humane aard van de microvasculaire vaten aan te tonen. Kleur de coupes met een commercieel verkrijgbaar anti-humaan CD 31-antilichaam in een verdunning van 1:100.

Deze fasecontrastopname toont de karakteristieke kasseistenenmorfologie van endotheliale cellen in een typische convergente monolaag van uit navelstrengbloed afgeleide e CFCs. Deze afbeelding toont de typische spoelvormige morfologie van uit menselijk beenmerg afgeleide MSCs. Na een incubatie van een week in de muisgast zag het implantaat, aangegeven door een gele stippellijn, er bij een hogere vergroting zeer anders uit dan de weefsels van de gastheer.

Meerdere microvaten bleken luminale structuren te bevatten met rode bloedcellen, welke zijn gemarkeerd met de gele pijlpunten. Bij immunohistochemisch onderzoek van de pluggen bleek het lumen van de microvaten reactief voor een monoklonaal antilichaam tegen humaan CD 31. De celkernen werden tegengekleurd met hematine.

Zodra deze technologie onder de knie is, kan deze binnen één ounce worden uitgevoerd mits dit correct gebeurt.