CD4 + T-lymfocyten Capture Met behulp van een Wegwerp Microfluïdische Chip voor HIV

Hallo, mijn naam is Richard Lin en ik ben onderzoeker in de groep van professor TI Mercy bij de Harvard MIT Division of Health Sciences and Technology. Het project waaraan ik werk, is het kwantificeren en vastleggen van CD4-positieve en C3-positieve T-lymfocyten. Hiervoor wordt patiëntenbloed gebruikt in omgevingen met beperkte middelen.

Hier voor me hebben we een microvullingsapparaat dat is samengesteld uit PDMS, oftewel polymethylsiloxaan. Het apparaat, het kanaal zelf, heeft een hoogte van 50 µm en het totale volume in het apparaat is 10 µL. Dit is dus een uiterst nauwkeurig apparaat dat we gaan gebruiken om T-helperlymfocyten op te vangen.

In feite de diagnostische benchmark voor hiv-patiënten. Het oppervlak van het microfluïdische apparaat is reeds geprepareerd met proteïne en er bevinden zich CD4-positieve antilichamen in de spuit. Op dit moment hebben we enkel PBS-biologische buffer bij een pH van 7.4 en we zullen dit nu door het kanaal laten stromen om het overtollige CD4-positieve antilichaam weg te spoelen.

In dit stadium hoeft de stroomsnelheid niet te worden gecontroleerd, omdat we enkel de overtollige vloeistof proberen uit te spoelen en de snelheid daarbij geen rol speelt. Hier bevinden zich de inlaatopeningen van het apparaat en hier zijn de uitlaatopeningen, aan mijn linkerzijde en aan uw rechterzijde. Ik zal nu de overtollige antilichaamoplossing uitspoelen. Als u naar de uitlaat kijkt, ziet u de vloeistof naar buiten komen; het is een zeer kleine hoeveelheid, maar bij nauwkeurige beschouwing is te zien dat er vloeistof via de slang uit het kanaal stroomt.

Nu we de extra antilichaamoplossing hebben weggespoeld, kunnen we ons voorbereiden op het injecteren van het bloed. Ik zal nu de slang van de inlaat loss koppelen. Vervolgens openen we een nieuwe spuit met bloed, menselijk volbloed.

Dit is dus geen patiëntmonster, maar een gezond monster van een gezonde proefpersoon, terwijl we ons voorbereiden om het bloed in het microfluïdische apparaat te injecteren. We bevestigen de spuit aan de spuitpomp. Nu schakelen we deze in en u kunt de stroomsnelheden van de spuit zien; we hebben deze ingesteld op 5 µL per minuut.

We bereiden ons nu voor om de injectie in het bloed uit te voeren. We plaatsen de spuitpomp verticaal, omdat bloedcellen sedimenteren en we willen dat de cellen in het kanaal stromen. We laten de cellen bij voorkeur naar de bodem sedimenteren, die zich vlakbij onze slang bevindt.

Alles is nu ingesteld en klaar voor gebruik. Het volume van mijn apparaat is 10 µL per 10 µL. En het volume dat we in de kanaalwand willen laten vloeien is ook 10 µL.

Ik kan bepalen of er voldoende bloed is ingestroomd door simpelweg naar de kleur van het kanaal te kijken; als het volledig rood en gevuld is, weet ik dat er 10 µL is ingestroomd en moet ik de spuitstop indrukken. Ik zal nu op de startknop drukken en het proces begint; soms duurt het even voordat het bloed daadwerkelijk het kanaal binnenstroomt. Dit komt grotendeels door de druk.

Wanneer we bijvoorbeeld de spuit plaatsen, trekken we soms vloeistof op of injecteren we deze om het bloed in de slang aan te passen. Dit kan enige tijd duren, maar zodra het in een kanaal begint te pompen, is de stroomsnelheid ingesteld op ly per minuut, wat het gewenste resultaat is. We moeten hier dus wat geduld hebben en wachten; soms moet u twee of drie minuten wachten voordat het bloed naar het kanaal begint te stromen.

U kunt nu zien dat het bloed het kanaal begint binnen te stromen. U kunt dus zien dat het apparaat nu bijna volledig is gevuld. Oké, we schakelen de slang nu terug naar PBS om het bloed uit het kanaal te spoelen.

Om dit te doen, herhalen we de stappen die we al hebben ondernomen om de slang te verwijderen. Aangezien we de stroomsnelheid van de PBS nog steeds moeten regelen, hebben we de spuitenpomp nog steeds nodig. Omdat er echter geen bloed meer stroomt, hoeft de spuitenpomp niet meer in een verticale positie te staan, aangezien er geen cellen in de PBS aanwezig zijn.

Nu alles is voorbereid, gaan we het bloed uit het apparaat spoelen en ik zal hier opnieuw op de knop 'sharp' drukken. Zoals u ziet, begint het apparaat nu schoon te worden. Aan de randen is nog wat bloed aanwezig, maar dit verdwijnt langzaam.

Zodra al het bloed is verwijderd, verhogen we de stroomsnelheid van 5 µL per minuut naar 20 µL per minuut. De reden voor deze wijziging is dat er in het bloed feitelijk twee celtypen aanwezig zijn met C4-positieve antigenen. Eén daarvan is waar we naar op zoek waren: de T-helperlymfocyten.

De andere zijn wat we monocyten noemen. We willen ervoor zorgen dat ons apparaat specifiek alleen de T-helperlymfocyten vastlegt in plaats van zowel de T-helperlymfocyten als de monocyten. De methode die we hiervoor gebruiken, is het verhogen van de stroomsnelheid, omdat we weten dat monocyten groter zijn dan T-helpercellen.

Door de stroomsnelheid te verhogen, zullen de grotere monocyten meer druk ervaren om het oppervlak te verlaten dan de CD4-positieve T-helpercellen. Dit proces duurt nu ongeveer 20 minuten. In mijn hand heb ik nu een oplossing.

Dit wordt de lysisoplossing voor erytrocyten genoemd. Het doel hiervan is om rode bloedcellen te lyseren. Overal waar rode bloedcellen in het kanaal achterblijven, zal deze oplossing ze lyseren.

Dit is 10 keer verdund vanaf de stamoplossing. We gaan nu de spuitpomp stopzetten, de slang verwijderen en in feite de oplossing vervangen door die uit deze spuit. Ik stop nu de machine, verwijder de slang, haal deze eraf, gebruik deze spuit en vervang hem door een nieuwe.

Nu alles is ingesteld, verlagen we de snelheid weer naar 5 µL per minuut. We wijzigen de snelheid van 20 naar 5 en laten nu gedurende 20 minuten de fax-lyse-oplossing doorstromen. We drukken nu op start.

Voor ons staat nu een optische afbeelding van het apparaat, genomen bij een 10 x vergroting. Hierop zijn al deze witte stippen te zien. Hoe kunnen we er nu zeker van zijn dat dit de cellen zijn waarnaar we op zoek zijn?

We gebruiken een paar verschillende kleurstoffen om te controleren; de eerste kleurstof die we gebruiken noemen we DAPI, wat de celkern kleurt. In feite worden alle cellen met een kern, zoals witte bloedcellen, gekleurd, terwijl rode bloedcellen, die geen kern hebben, niet worden gekleurd. Je kunt dat over de hele afbeelding zien; dit zijn allemaal blauwe stippen en elke enkele daarvan is blauw.

is een cel. De volgende stap is nu controleren of de cellen beschikken over wat we het C4-positieve antigeen noemen. Dit is uiterst belangrijk, omdat het hele doel van ons apparaat is om C4-positieve cellen op te vangen.

Vervolgens is het fluorescerende antilichaam dat we gebruiken uiteraard C4-specifiek. Ga naar de volgende dia. Op deze afbeelding zijn de cellen veel zwakker zichtbaar omdat het fluorescerende antilichaam dat we gebruiken meestal voor facts is.

De verdunning is dus veel hoger. Maar als u goed kijkt, is nog steeds te zien dat er stippen verspreid over dit gezichtsveld liggen. Deze zijn vrij zwak.

Maar bij nadere inspectie kunnen we vaststellen dat deze cellen CD4-positief zijn, wat gunstig is omdat dit precies is wat we willen. De volgende test is, zoals ik eerder al noemde, dat er twee verschillende typen CD4-positieve cellen zijn. De ene groep zijn de cellen die we zoeken, de T-helpercellen, en de andere groep is wat we monocyten noemen.

Daarom hebben we opnieuw een fluorescent antilichaam nodig om onderscheid te maken tussen de twee cellen. We weten namelijk dat T-helperlymfocyten beschikken over what we noemen CD3-positieve antigenen, terwijl monocyten dat niet hebben.

Het volgende antilichaam dat we gebruiken is specifiek voor CD3, wat we in deze afbeelding zien. Opnieuw is te zien dat er stippen verspreid over het apparaat liggen; de stippen lijken groter omdat sommige cellen soms helderder oplichten dan andere. Ik bedoel, in dit geval hangt veel af van het toeval, maar in de meeste gevallen zijn deze stippen, de helderrode stippen, allemaal cellen.

Dus we willen, nogmaals, enerzijds bevestigen dat onze cellen CD4-positief en CD3-positief zijn. In dit geval is te zien dat veel van onze cellen CD3-positief zijn, wat gunstig is. Dit zorgt voor specificiteit bij onze capture.

De grote stippen kunnen artefacten zijn, maar vaak gebeurt het dat een cel simpelweg meer CD3-moleculen op zichzelf heeft verzameld. Op deze afbeelding ziet u een van de datasets die we hebben verzameld voor dit microfluïdische apparaat, wat in feite een celvangstprotocol is. In de vorige dia's kunt u zien dat er veel afbeeldingen waren waarop cellen te zien waren.

Maar tot wat leiden ze nu precies? Nou, ze leiden tot een celopvangprofiel, waarbij we op de X-as de afstand vanaf de inlaat kunnen uitzetten en op de Y-as de opgevangen cellen per schijf. Je kunt zien dat de dichtheid door het hele apparaat heen aanvankelijk extreem hoog is en daarna langzaam afneemt, wat is wat we zouden verwachten, aangezien we de C4-positieve en C3-positieve cellen uit de bloedstroom opvangen en er een afnemende concentratie van die cellen in het bloedmonster zal zijn.

En dit is in feite hoe onze gegevens gewoonlijk worden gepresenteerd.