Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis-complex voor de eerste en tweede lijn drugs door de bouillon verdund in een microtiterplaat Format

Er zijn relatief weinig geneesmiddelen beschikbaar voor de behandeling van Mycobacterium tuberculosis, waardoor resistentie tegen elk middel een punt van zorg is. Dit videoartikel beschrijft een procedure voor het gelijktijdig testen van de antibioticaresistentie van M. tuberculosis tegen 12 verschillende microbiële geneesmiddelen. De mogelijkheid om antimicrobiële resistentie van M. tuberculosis snel te detecteren is daarom zeer belangrijk in de inspanning om de toename van resistente stammen te beheersen; hier wordt de antibioticasusceptibiliteit getest.

M tuberculosis wordt eerst gekweekt op vaste media of in bouillonmedia, resulterend in een bacteriële suspensie. Het inoculum wordt klaargemaakt en toegevoegd aan een microtiterplaat met verschillende concentraties van 12 geneesmiddelen, waaronder eerstelijns- en tweedelijnsmedicatie. Na incubatie wordt de mate van groei in elke put handmatig bepaald met behulp van een spiegelkast of met een semi-automatische plaatlezer.

De resulterende gegevens geven de minimale inhiberende concentratie voor elk getest geneesmiddel aan en laten zien tegen welke antibiotica de geteste TB-stam resistent is. Deze resultaten helpen bij het kiezen van het juiste geneesmiddel voor de behandeling van tb. Hallo, mijn naam is Nancy Ek en ik ben directeur van het Myco Bacteriology Laboratory aan de Mayo Clinic in Rochester, Minnesota.

Vandaag beschrijven we een methode voor het uitvoeren van antibioticagevoeligheidstesten voor Mycobacterium tuberculosis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals macro-bouillonverdunning, is dat er voor elk geneesmiddel een MIC wordt bepaald en dat er 12 antibiotica gelijktijdig worden getest. De procedure zal worden gedemonstreerd door Kurt Jude, een kwaliteitspecialist in mijn laboratorium, werkend aan een laboratoriumbank.

Bereid deze procedure voor door een bloedagarplaat, drie Middlebrooks 7H10-platen, een buis met saline tween-glasparels en een microtiterplaat te labelen met de naam van de patiënt en het identificatienummer van het monster. Label daarnaast de bloedagar- en 7H10-platen als zuiverheid. Label één van deze 7H10-platen als 1:1 kolonietelling en de andere als 1:50 kolonietelling.

Plaats vervolgens het dienblad in de doorgeefsluiz. Bereid u daarna voor om te werken in de biosafety level 3 (BSL-3) faciliteit door een jas met gesloten voorkant, een hoofdkap, handschoenen, schoenhoezen en een ademhalingsbeschermingsmiddel aan te trekken. Hier wordt een PAPR-ademhalingsapparaat gebruikt.

Haal vervolgens de lade uit de sluis. Desinfecteer daarna, in de BSL-3 faciliteit, het oppervlak van de biologische veiligheidskast. Plaats vervolgens een met desinfectiemiddel doordrenkt papieren handdoekje in de kast, ongeveer zes inch van het luchtventilatiepaneel naast het papieren handdoekje.

Zet inoculatiehaken, pipetteerders en tips, een geschikte afvalcontainer, een nephi, TER en een vortex klaar. Zodra de zuurkast is voorbereid, plaatst u het organisme op het papieren handdoekje samen met een rek met een McFarland 0.5 standaard, een seven H nine bouillon met OADC en een buisje met zoutoplossing-beads. Deze opstelling wordt uitgevoerd vanuit een vast medium.

Bereid een inoculum voor vanuit een cultuur op een vast medium van een patiëntmonster. Gebruik een steriele lus om de kolonies af te schrapen en breng deze over in de glaskraalbuis met saline tween. Vortex de suspensie gedurende 30 tot 60 seconden.

Inspecteer het monster visueel door het te vergelijken met de McFarland-standaard. De overgedragen hoeveelheid moet gelijk aan of groter dan de standaard zijn. Zo niet, voeg dan meer van het bacteriële monster toe en vortex opnieuw.

Zodra de McFarland-standaard is bereikt, laat u het inoculum 15 minuten bezinken zodat grotere klonten bacteriën naar beneden zakken. Gebruik vervolgens een nefi TER om de dichtheid van de gesuspendeerde bacteriën naar nul te meten. De nephi ter.

Plaats eerst een blanco zoutoplossing-kralenbuis in de nephi ter. Druk op de kalibratieknop om het instrument op nul te stellen, plaats vervolgens de McFarland 0,5-standaard in de Nephi ter en druk opnieuw op de kalibratieknop. Zodra het instrument is gekalibreerd, verwijdert u de McFarland-standaard en plaatst u het inoculum.

De aflezing van het inoculum moet gelijk zijn aan de aflezing van de McFarland-standaard. Als de aflezing te laag is, haal dan de buis eruit en breng meer bacteriën van de plaat over. Vortex vervolgens en lees het monster opnieuw af.

Als de aflezing te hoog is, voeg dan saline tween toe aan de buis en vortex deze. Lees het monster vervolgens opnieuw af. Blijf het inoculum naar behoefte aanpassen totdat de bacteriële concentratie overeenkomt met de McFarland-standaard.

Gebruik vervolgens een 200 µL pipet en een lange aerosolbestendige pipetpunt om 100 µL inoculum uit het bovenste derde deel van de buis te verwijderen. Om te voorkomen dat klontjes naar de bodem van het Middlebrook 7H9-bouillon zakken, wordt het geïnoculeerde bouillon langzaam 20 seconden gevortext om het inoculum uit te platen. Begin met het uitpakken van de microtiterplaat uit de verpakking van de fabrikant. Als het droogmiddel blauw is of als de folieverpakking beschadigd is, mag deze niet worden gebruikt.

De plaat bevat al de 12 antimicrobiële middelen die in elke put getest moeten worden, inclusief de meest effectieve of eerstelijnsmiddelen en tweedelijnsmiddelen. Giet het inoculum van de H nine-bouillon voorzichtig in een buis, waarbij u er op let dat er geen aerosolen ontstaan. Plaats vervolgens de microtiterplaat met het label naar buiten, zoals hier getoond, en gebruik een 12-kanaals pipetteerder om 100 µL van het inoculum aan elke put toe te voegen.

Bereid vervolgens de platen voor om kolonietellingen uit te voeren. Bereid eerst een onverdunde plaat voor door een ene microliter loop monster van de positieve controleput over te brengen naar de 7 H 10-plaat met het label één op één. Gebruik daarna de loop om de plaat uit te strijken zoals hier wordt getoond.

Bereid vervolgens een verdunning van 1:50 door een loop van 1 µL vanuit de put van de positieve controle over te brengen en deze te mengen in de buis met 50 µL water. Streken vervolgens 1 µL van deze verdunning uit op de plaat met het label 1:50. Inoculeer de zuiverheidsplaten door 50 µL van het inoculum uit het bouillon over te brengen op correct gelabelde bloedagar- en 7H10-platen en streken deze uit voor isolatie.

Stapel vervolgens een andere trth bovenop de geïnoculeerde trth en plaats deze voorzichtig in de afvalbak. Breng een klevende afdichting aan op de microtiterplaat. Druk vervolgens, met behulp van de witte achterzijde, stevig op elke well om een adequate afdichting te garanderen, waarbij u erop let dat er geen kreukels ontstaan.

Desinfecteer de microtiterplaat door deze af te nemen met een papieren handdoek gedrenkt in een tuberculocidaal desinfectiemiddel. Plaats de microtiterplaat vervolgens in een plastic zak en sluit deze af met een hittezegeling. Desinfecteer tot slot alle materialen, inclusief de pipetspunt-filters, vortex, platen en buizen, door ze af te nemen met een tuberculocidaal desinfectiemiddel.

Hier wordt pro spray gebruikt nadat er voldoende tijd is verstreken om desinfectie te garanderen. 15 minuten voor pro spray. De platen worden afgeplakt met plakband, in plastic zakken geplaatst, en de verzegelde benodigdheden worden uit de biologische veiligheidskast gehaald en in de sluis geplaatst.

De rode afvalzak wordt op dit punt gesloten en afgesloten met een twist-tie, waarna de jas, overschoenen en handschoenen worden uitgetrokken. Ga vervolgens naar de sluis en was de handen; verwijder daarna het ademhalingsapparaat, desinfecteer dit en berg het op. Was de handen opnieuw, trek een schone jas aan en verlaat de BSL-3 suite. Vervolgens wordt de afvalcontainer geautoclaveerd.

Incubeer vervolgens de microtiterplaat en de zeven H 10- en bloedagarplaten rechtop in de incubator bij 35 tot 37 °C met 5 tot 10% CO2 in het BSL-2 laboratorium. Dit is acceptabel omdat de plaat goed is afgesloten en zich in een plastic zak bevindt. De generatietijd van Mycobacterium tuberculosis is ongeveer 12 tot 24 uur, dus het zal minstens een week duren voordat groei zichtbaar is als de vorming van een celpellet onderin de controleput. Voer op dag 10 een handmatige MIRERA-uitlezing uit door de afgesloten AST-microtiterplaat op het platform van de MIRERA-box te plaatsen.

Gebruik een bureaulamp om de visualisatie van de groei te ondersteunen en pas deze naar behoefte aan om het beste contrast te verkrijgen. Controleer de groeicontroleputjes, in dit geval H 11 en H 12, door in de spiegel te kijken. Als er sprake is van groei, zal het putje troebel lijken of sediment vertonen, zoals hier wordt getoond.

Als er geen groei is, zoals in dit voorbeeld, zal de well er helder uitzien. Plaats de plaat in dat geval terug in de incubator en zet de incubatie voort voor maximaal 21 dagen. Vergelijk voor elke conditie de groei met de controle.

Vervolgens is voor elk geneesmiddelrecord de eerste verdunning zonder groei de minimale inhiberende concentratie of MIC van het geneesmiddel. Om de resultaten met een geautomatiseerde platenlezer zoals de Vision te onderzoeken, begint u met het openen van de MycoTB AST-platensoftware en het inloggen; plaats de verzegelde plaat met de barcode naar buiten gericht. Zoals hier getoond, verschijnt groei als troebeling of als een neerslag van cellen op de bodem van een putje op het computerscherm.

Controleer eerst de groeicontroles. Zoals voorheen. Als er geen groei is waargenomen, plaats de plaat dan opnieuw in de incubator voor maximaal 21 dagen.

Als dit positief is, worden de resultaten geregistreerd door voor elk geneesmiddel op het scherm de eerste put aan te raken die geen groei vertoont. In sommige gevallen precipiteren bacteriën, sediment of geneesmiddelen naar de bodem van de put. Dit fenomeen, bekend als trailing, wordt gekenmerkt door meerdere putten met een pellet van dezelfde grootte en wordt niet beschouwd als daadwerkelijke positieve groei.

Vervolgens worden de zeven H 10- en bloedagarplaten onderzocht om de bacteriële concentraties te bepalen en de zuiverheid te beoordelen. De bloedagarplaat mag na 48 uur geen groei vertonen. Groei op de bloedagarplaat duidt op contaminatie met snelgroeiende bacteriën.

Indien er groei is, moet de microtiter-test worden herhaald. De plaat met H 10 zuiverheid zou groei van één organisme moeten vertonen. Type EM tuberculosis moet beige van kleur, rimpelig en ruw verschijnen. Bij contaminatie moet de microtiter-test worden herhaald vanaf een zuivere cultuur.

Om de bacteriële concentratie te beoordelen, telt u de kolonies op de H 10-plaat van zeven. Bereken vervolgens de koloniegetallen met behulp van de tabel in het bijbehorende geschreven document. Mycobacterium tuberculosis is gekweekt uit een patiëntensample en de antibioticaresistentie is beoordeeld zoals beschreven in deze video; op de hier getoonde plaat zijn 12 verschillende geneesmiddelen aanwezig in toenemende concentraties, met de hoogste concentraties bovenaan en de laagste concentraties onderaan.

De minimale inhiberende concentratie, of MIC van het geneesmiddel, werd aangegeven door de laagste concentratie van het middel die geen groei vertoonde en is omcirkeld in de hier getoonde afbeelding aan de hand van gestandaardiseerde breekpunten vastgesteld door het Clinical and Laboratory Standards Institute. De hier getoonde gegevens suggereren dat deze TB-stam resistent zal zijn tegen Isid en Rifampine. In vitro suggereren de hoge MIC-waarden waargenomen bij verschillende andere geneesmiddelen, waaronder oin, moxifloxacine, streptomycine en rifabutine, de resistentie van de EM-tuberculosestam tegen deze middelen.

De MIC-resultaten dienen te worden gebruikt door een infectieziektespecialist met ervaring in de behandeling van tuberculose om een individueel behandelplan op te stellen. Wanneer de techniek onder de knie is, duurt het opzetten van één isolaat ongeveer 40 minuten. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat dit een respiratoire pathogeen is en dat er aerosolen kunnen ontstaan. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het opzetten van antimicrobiële gevoeligheidstesten voor Mycobacterium tuberculosis met behulp van de micro-bouillonverdunningsmethode. Vergeet niet dat werken met Mycobacterium tuberculosis extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals ademhalingsbescherming, altijd moeten worden genomen waar dat vereist is.