Microfabricated Post-Array-Detectoren (mPADs): een benadering van mechanische krachten Isoleer

Hoi, ik ben Nathan Snia Decky en vandaag ben ik vergezeld door Wes Ligan, Robbie Desai en Mike Yang. Wij komen uit het laboratorium van Chris Chen hier aan de University of Pennsylvania. In deze video presenteren we onze methode om cellulaire attractiekrachten te meten met behulp van een microgefabriceerde array van micropilaartjes.

Tractiekrachten worden gegenereerd door interacties tussen myosine en actine en spelen een belangrijke rol in onze fysiologie. Tijdens de ontwikkeling stellen ze cellen in staat om van de ene naar de andere locatie te bewegen om de vroege structuren van ons weefsel te vormen. Daarnaast helpen ze bij het genezingsproces, omdat ze noodzakelijk zijn voor het sluiten van wonden of de migratie en het kruipen van leukocyten door ons lichaam.

Helaas kunnen dezezelfde krachten echter nadelig zijn voor onze gezondheid in het geval van kankermetastasen of vasculaire groei richting een tumor. Er zijn daarom zeer weinig methoden waarmee men deze tractiekrachten daadwerkelijk op een kwantitatieve manier kan meten, en zeker niet op de micro- en nanoschaal van individuele cellen. De meeste gangbare methoden om cellen in vitro te bestuderen, maakten gebruik van schaaltjes met een glazen bodem of polystyreen schaaltjes, maar dit zijn zeer rigide substraten die het niet mogelijk maken om de tractiekrachten en de vervormingen die een cel veroorzaakt fysiek te meten.

Het is daarom erg moeilijk geweest om de onderliggende mechanismen van tractiekrachten te begrijpen zonder een vorm van fysieke uitlezing. In het laboratorium van Chris Chen beschikken we daarom over een techniek waarmee we deze beperkingen kunnen overwinnen. Onze methode is gebaseerd op een verticale reeks flexibele cantilevers, waarvan de stijfheid en schaal zodanig zijn dat individuele cellen zich over meerdere cantilevers verspreiden en deze tijdens dat proces doen afbuigen.

De dimensies die we het meest gebruiken zijn cilindrische palen met een diameter van 3 µm, een hoogte van 10 µm, een hart-op-hart afstand van 9 µm en een rechthoekige opstelling. Deze dimensies kunnen echter worden aangepast om diverse cellulaire studies te faciliteren. We beginnen met een starre silicium-master die u hier ziet, en vertalen deze vervolgens naar flexibele PDMS-cantilevers die we hier zien.

Met deze techniek kunnen we de afbuigingen van individuele cantilevers onder een microscoop meten en de cellulaire tractiekrachten berekenen met de grootte en richting die nodig zijn om dergelijke afbuigingen te veroorzaken. We hebben deze substraten omgevormd tot M-pads voor micropost-arraydetectoren en in deze video laten we u zien hoe u de M-pads fabriceert, beginnend bij de siliconen master via de PDMS-replicatie, tot slot leidend naar de berekening van modulatie en cellulaire contractiliteit. Hallo, we zijn hier in de cleanroom van ons laboratorium.

Dit is een stofvrije en lichtgevoelige ruimte waarin we de SU-8 posts kunnen maken die als silicium master zullen dienen. We beginnen met een siliciumwafer en coaten deze met SU-8 fotolak; SU-8 is een negatieve resist en is lichtgevoelig. Wanneer we licht door dit fotomasker schijnen, zorgt het licht voor het patroon van de microposts en vormt er een driedimensionale structuur, wat resulteert in de SU-8 posts waarin we vervolgens PDMS gieten.

Nadat we alle bewerkingen hebben voltooid, zal de wafer er zo uitzien, waarbij de micropilaar- en micropoststructuren al in de wafer zijn gefabriceerd. Om de masters te maken, beginnen we eerst met een onbehandelde siliciumwafer; deze is zeven minuten lang gereinigd met een ozonbehandeling en we hebben deze wafer ook 30 minuten lang gedehydrateerd bij 120 °C. We gaan SU-8 2002 op de wafer spinnen om een zeer dunne basislaag voor de posts te vormen.

Omdat we met SU-8 gaan spinnen, draag ik een gasmasker. Plaats de wafer opnieuw in deze houder, verwijder eventueel stof dat er op zit en plaats deze op de spinner. We controleren of de wafer gecentreerd is en vervolgens gieten we de SU-8 2002 hierop. Daarna gaan we de wafer spinnen. Vervolgens plaatsen we deze op de hotplate voor het soft bake-proces.

Dit laten we vervolgens één minuut lang doorgaan. Daarna nemen we het monster en plaatsen we het op de warmteplaat van 95 °C. Dit doen we gedurende twee minuten.

Zodra dit voltooid is, gaan we over tot de vloedbelichting in de mask-aligner. We hebben nu de eerste laag SU-8 op deze wafer gesponnen en nu moeten we de gehele wafer vloedbelichten om die eerste basislaag voor de micropalen te creëren. Hiervoor is een belichting van 70 millijoules nodig.

We moeten vervolgens de werkelijke lichtintensiteit in onze mask-aligner meten. Hiervoor plaatsen we de meter in de mask-aligner. Daarna belichten we deze met licht.

Dit is UV-licht. We laden de siliciumwafer op de mask-aligner en plaatsen deze in de mask-aligner. Deze keer gebruiken we geen masker, zodat we de gehele film kunnen belichten.

Plaats de sluiter en stel de belichtingstijd in op één minuut, waarna we gaan belichten. Zodra de belichting na één minuut is voltooid, kunnen we de wafer verwijderen. Vervolgens moeten we het nabelichtingsbakken (post-exposure bake) uitvoeren.

Nu we deze wafer hebben belicht, gaan we warmte toevoegen om de cross-linking reactie voor deze eerste SU-8 coating te induceren. We plaatsen de wafer gedurende één minuut op een warmteplaat van 65 °C en brengen deze vervolgens over naar een warmteplaat van 95 °C voor twee minuten. Na dit proces van twee minuten schakelen we de warmteplaat uit en laten we de wafer afkoelen tot kamertemperatuur, wat ongeveer 30 minuten duurt.

We hebben nu onze tweede laag SU-8 op deze wafer gesponnen. Nu moeten we deze daadwerkelijk belichten via het fotomasker. Deze keer gebruiken we een UV-filter om dat diepe UV-licht te blokkeren.

Dit is een Hoya-optisch glas dat verkrijgbaar is, maar nu moeten we opnieuw de intensiteit meten. Daarom gaan we onze lichtmeter gebruiken, of we gaan het filter aan de bovenzijde gebruiken om de intensiteit te meten die is weggefilterd. Vervolgens laden we het masker in de mask-aligner.

Deze schakelaar creëert het vacuüm dat het masker op zijn plaats houdt. Vervolgens plaatsen we het in de mask aligner. Daarna plaatsen we het filter bovenop en laden we onze wafer in.

We willen ervoor zorgen dat er een goed contact is, dus we brengen het omhoog tot het contact is gemaakt en daarna starten we de belichting. Na de belichting halen we de wafer uit de mask-aligner. Er zijn nu gebieden die selectief zijn belicht. We brengen dit naar de oven of de hotplates om het nabewerkingsbakken (post-exposure bake) uit te voeren.

We hebben zojuist het uiteindelijke bakproces na belichting (post-exposure bake) voltooid, en nu gaan we deze wafer ontwikkelen zodat we daadwerkelijk de driedimensionale structuren kunnen verkrijgen. We gaan dit wassen en ontwikkelen in PGMEA, wat het onbelichte SU-8 zal wegnemen. We beginnen eerst in een schaal met PGMEA en laten de wafer hier twee minuten in rusten met lichte agitatie.

Ik laat dit twee minuten inwerken. Vervolgens brengen we het over naar een tweede schaaltje met PGMEA. Hiermee wordt de verzadigde PGMEA met SU-8 verwijderd.

Na 10 seconden brengen we het over in IPA. Dit wast het P-G-M-E-A weg. We laten het hier 20 seconden in, opnieuw met een milde agitatie.

En we hebben nu de vrijstaande poststructuren. We gaan deze in hexaan plaatsen, dat een lage oppervlaktespanning heeft. We wassen ze vijf seconden in één en vervolgens in twee hexanen, waarna we ze kunnen droogblazen.

Nu we de wafer hebben ontwikkeld, plaatsen we deze op een warmteplaat en verhogen we de temperatuur langzaam tot 150 °C. Door deze hogere temperatuur wordt het SU-8 verder gecrosslinkt, waardoor het structureel stijver wordt. We laten de wafer de hele nacht op deze warmteplaat staan, gedurende 14 tot 20 uur, waarna we de warmteplaat uitschakelen en de wafer weer laten afkoelen tot kamertemperatuur.

Wat we nu moeten doen, is deze wafer in kleinere stukken snijden. We willen deze siliciumwafer in feite doorknippen om een kleine chip te maken van alleen dit binnenste patroon hier. Dat zal er ongeveer uitzien als die structuur daar, waarbij epoxy wordt gebruikt.

Vervolgens lijmen we die chip op een glazen objectglas zoals hier getoond. Dit dient als structurele ondersteuning. Het dicingen van een wafer is een soort kunst, maar wat u kunt doen is in feite een diamantschrijver gebruiken en bij slechts één rand beginnen.

En vanwege de kristalvlakken maakt u nu een kleine inkeping. Hiermee is een breuklijn ontstaan, waar ik vervolgens met dit instrument op kan tikken. We kunnen dit wegpellen en we kunnen hier meer snedes aanbrengen totdat we een kleine structuur zoals deze hebben. Vervolgens plaatst u de siliciumchip snel op het glas en monteert u deze op zijn plek. Laat dit vervolgens uitharden.

Wanneer u klaar bent, heeft u een apparaat dat vergelijkbaar is met deze. We hebben de silicium master op deze glazen objectglas gemonteerd en nu gaan we deze voorzien van een coating van floy, wat later zal helpen bij het losmaken van deze structuur van de PDMS. We plaatsen de chip in deze desiccator en vervolgens voegen we een paar druppels van dit tri-chloro-silaan toe aan de desiccator.

We doen dit in de zuurkast omdat dit een bijproduct van zoutzuurgas heeft, wat vrij corrosief is. Sluit vervolgens het deksel, sluit dit aan op het vacuüm en we laten dit vervolgens staan met het vacuüm aan; we laten dit een nacht lang deposeren om een mooie coating over de gehele siliciumwafer te krijgen. Hallo, ik ben Wesley Ligan.

Ik ben een promovendus in het laboratorium van Christopher Chen. Op dit punt heeft Nate u laten zien hoe u een siliconen master maakt voor onze ED-substraten. Voordat we dit instrument echter kunnen gebruiken om de cellulaire contractiliteit te meten, is het noodzakelijk om eerst de rigide fotostructuren te repliceren met behulp van een elastomeer siliconenpolymeer.

Onze eerste taak is het maken van een negatieve mal van de siliconen master die we eerder hebben vervaardigd. Hiervoor gebruiken we een siliconen elastomer genaamd PDMS of polymethylsiloxaan. We voegen nu een uithardingsmiddel toe in een verhouding van 1 op 10 aan ons PDMS-polymeer.

Zodra de oplossing is afgewogen, is het noodzakelijk om het PDMS-polymeer en het crosslinking-agens grondig te mengen. Dit mengen introduceert uiteraard veel luchtbellen in onze oplossing. Daarom is het op dit punt nodig om het mengsel af te dekken en te ontgassen in de vacuümdesiccator.

Zodra het PDMS volledig is ontgast en alle bellen naar het oppervlak zijn gestegen en zijn geknapt, kunnen we het uit de vacuümdesiccator halen. We kunnen dit mengsel van PDMS en cross-linking agent nu gebruiken om een negatieve mal van onze silicium master te maken. Hiervoor gebruiken we een aluminium bakje waarin we de gemonteerde silicium master in het midden plaatsen.

Vervolgens gieten we de polymeeroplossing van de DGA's voorzichtig in de schaal over de siliciumwafer, waarbij we proberen te voorkomen dat er extra luchtbellen ontstaan. Normaal gesproken proberen we het polymeer met een dikte van ongeveer een kwart inch te gieten. Zoals te zien is, introduceert dit proces onvermijdelijk enkele luchtbellen in het mengsel.

We zetten dit schaaltje nu ongeveer 30 minuten opzij zodat de bellen naar het oppervlak kunnen stijgen en knappen. We kunnen zien dat er, nadat het heeft gestaan, nog steeds enkele luchtbellen aan het oppervlak van de PDMS aanwezig zijn. Omdat deze zich echter aan het bovenoppervlak bevinden, kunnen we nu een korte stoot stikstof gebruiken om de resterende bellen te laten knappen.

Om de PDMS- en CROSSLINKER-oplossing volledig te crosslinken en een rigide negatieve mal van onze silicium master te genereren, bakken we deze 20 minuten bij 110 °C. We kunnen zien dat er een dunne laag PDMS bovenop het siliciumsubstraat ligt. Voordat we de twee van elkaar kunnen scheiden, is het noodzakelijk om deze laag eerst weg te snijden.

Vervolgens kunnen we deze bovenlaag enten en voorzichtig van het siliciumsubstraat afpellen. Op dit punt kunnen we het negatieve siliciumsubstraat, het negatieve PDMS-substraat, omkeren en zeer langzaam van de siliconen master afpellen. Dit doen we door één uiteinde vast te houden en het PDMS-substraat voorzichtig af te pellen.

U kunt zien hoe het front vordert terwijl het substraat loslaat van de siliconen master. Nu we een PDMS-negatieve mal van onze siliconen master hebben gemaakt, kunnen we deze in vier individuele negatieve mallen snijden om de definitieve pad-substraten te maken. Het is op dit punt belangrijk om de bovenkant van het negatieve substraat niet aan te raken met pincetten of handschoenen om beschadiging van het oppervlak te voorkomen.

Op dit punt hebben we vier individuele negatieve mallen gegenereerd vanuit de siliconen master, bestaande uit putjes met een diameter van 3 µm en een diepte van 9 µm. Om de verhoogde cantilever-oppervlakken opnieuw te creëren, kunnen we opnieuw gieten op deze negatieve mallen met PDI PDMS onder gebruik van PDMS. Voordat we dat echter doen, is het noodzakelijk om deze negatieve mallen eerst niet-klevend te maken door ze te coaten met een fluoros.

We voeren dit uit in een plasma chamber van honderd watt op vol vermogen gedurende één minuut. Nadat de kamer is leeggepompt, wordt het plasma opnieuw ingeschakeld; dit genereert een iongasveld dat het PDMS-bovenoppervlak etst en het adhesiever maakt voor de fluoro Cy Lane-moleculen. Na het verwijderen van de negatieve mallocs uit de vacuümdesiccator is hier te zien dat we achterblijven met een array van putjes van 3 µm bij 10 µm diep in een niet-adhesieve PDMS-laag.

Om de verticale cantilevers te regenereren die we gebruiken voor de mpad-substraten, is het nodig om opnieuw te gieten met dezelfde PDMS-mengeling; dit resulteert in een vrijstaande positieve array van elastomere cantilevers die een identieke spiegeling vormen van de silicium master die we eerder hebben gefabriceerd. De eerste stap in deze procedure is het overbrengen van onze niet-adhesieve negatieve mallen naar een montageapparaat dat we hebben gemaakt van PDMS-strips en een glazen microscoopglasplaatje. De reden voor dit apparaat zal in de volgende stap duidelijk worden.

Op dit punt kunnen we een kleine druppel van hetzelfde mengsel van PDMS en crosslinker in een verhouding van 10:1, dat reeds is ontgast, op het bovenoppervlak van elk van onze negatieve mallen aanbrengen. Er is slechts een kleine hoeveelheid PDMS nodig, zodat deze niet over de rand van de negatieve mallen loopt. Op dit punt.

Om het PDMS gelijkmatiger over het bovenoppervlak van de mallen te verspreiden, kunnen we er één met een pincet pakken, omdraaien en in contact brengen met de aangrenzende mal, waarbij het PDMS voorzichtig wordt verspreid om het gehele substraat volledig te bedekken. Wees in deze stap zeer voorzichtig om geen extra luchtbellen in de bovenste PDMS-oplossing te introduceren; dit proces kan vervolgens worden herhaald met de andere twee mallen. Nu we een uniformere PDMS-coating over het bovenoppervlak hebben, kunnen we deze mal in een vacuümdesiccator plaatsen om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen die gevangen kunnen zitten in de PDMS-film bovenop onze negatieve mallen.

Dit proces duurt doorgaans ongeveer 30 minuten. Terwijl onze negatieve mallen ontgassen, kunnen we de glazen substraten van 22 bij 22 millimeter reinigen, die de uiteindelijke montageplaats voor de pads zullen worden. De eerste stap in dit proces is het wegblazen van eventuele stofdeeltjes met behulp van samengeperst stikstof.

We zullen de glazen dekglasjes blootstellen aan gasplasma, waardoor het oppervlak wordt geëtst en de adhesie met de PMS toeneemt, die we in de volgende stap zullen aanbrengen. Nadat de bovenste laag PDMS ongeveer 30 minuten lang heeft kunnen DGAs en de glazen dekglasjes plasma-geactiveerd zijn, kunnen we de mal verwijderen en het bovenoppervlak van de glazen dekglasjes, dat aan het gasplasma is blootgesteld, in contact brengen met de PDMS-laag bovenop de negatieve mallen. Meestal is het nuttig om eerst één rand van het glazen dekglasje in contact te brengen met de PDMS en vervolgens het resterende deel van het glazen dekglasje in een SH te laten zakken, zodat de PDMS zich als een vel uitspreidt.

Dit helpt om eventuele bellen in de PDMS-film te verminderen. Op dit punt kunnen we met onze pincet voorzichtig op het bovenste oppervlak van het glazen dekglas drukken om overtollig PDMS naar buiten te duwen en het dekglas tegen het PDMS-kruis in het midden van het sjabloon te schuiven. Dit voorkomt dat het dekglas verschuift terwijl de PDMS uithardt.

We herhalen dit voor de andere substraten. Op dit punt kunnen we de gehele template in de oven plaatsen en bakken bij 110 °C gedurende 22 uur. Nadat de gehele opstelling is afgekoeld tot kamertemperatuur, kunnen we de substraten verwijderen, omdraaien en de negatieve mal voorzichtig van het glazen dekglas afpellen.

Het is belangrijk om dit langzaam en gelijkmatig te doen om te voorkomen dat de pilaren worden verbrijzeld of van het glazen substraat worden gescheurd. We kunnen zien dat we, na het verwijderen van de negatieve mal, een array van cantilevers overhouden die het silicium masterprecies nabootst, maar die nu zijn geconstrueerd uit een flexibel PDMS-elastomeer. Oké, op dit punt hebben we u meegenomen in hoe we de silicium master van onze Emad-substraten genereren.

Vervolgens hebben we een replica-gietproces gebruikt om een exacte kopie te maken met behulp van A-P-D-M-S elastomeerpolymeer, zodat de cantilevers nu flexibel zijn om de cel in staat te stellen uit te spreiden en samen te trekken, waarbij de cantilevers worden afgebogen. Op dit punt zijn onze substraten klaar voor verwerking voor celkweek. Nu we hebben gezien hoe we mallen kunnen vervaardigen en repliceren om de EDS te maken, gaan we nog een paar stappen uitvoeren om de EDS functioneel te maken, zodat we cellen kunnen kweken en vervolgens de tractiekrachten kunnen analyseren.

Maar voordat we dat doen, moeten we drie dingen doen. Ten eerste moeten we de uiteinden van de pilaren adhesief maken voor cellen. Ten tweede moeten we het PDMS fluorescent labelen om de visualisatie en analyse van de doorbuiging van de pilaren te ondersteunen.

Ten derde moeten we de zijwanden van de palen, evenals de basis van de palen, niet-adhesief maken voor cellen, zodat tractiekrachten alleen bij de tips van de palen worden uitgeoefend. In de volgende minuten zullen we zien hoe deze stappen verlopen via een strategie gebaseerd op microcontactprinten. Maar eerst is de volgende stap het verwijderen van overtollig PDMS van de eds.

Zoals ik al aangaf, is de eerste stap het pakken van het EDS-substraat, waarvan West zojuist heeft laten zien hoe het moet worden gegenereerd en bijgesneden. Het overtollige PDMS dat ontstond door het glazen dekglas tegen de negatieve mal te uitharden, wordt met een scherp scheermesje weggesneden. Dit doet u door het scheermesje verticaal op het substraat te plaatsen aan de rand van de pilaren en het overtollige PDMS vervolgens weg te schrapen.

U kunt één vinger gebruiken om het dekglas op zijn plaats te houden, zodat het dekglas niet verschuift. We hebben nu dus een M-pad substraat dat is gereinigd van vuil en daardoor gemakkelijk toegankelijk is. Voor de volgende stap moeten we de MPA's via microcontactdruk printen om de uiteinden van de posts adhesief te maken.

Om dit te doen, moeten we eerst stempels genereren, en dit proces is zeer eenvoudig. We mengen PDMS simpelweg in een verhouding van 1:30 in plaats van 10:1. We gieten dit in een Petrischaal zodat de hoogte van het PDMS ongeveer 1 cm is.

Laat het ontgassen. Dit betekent dat de bellen naar de bovenkant van de PDMS moeten stijgen; vervolgens wordt de cross-linking reactie uitgehard in de oven bij 60 °C gedurende één uur. Nadat de schaal uit de oven is gehaald en is afgekoeld, ben ik klaar om de stempels uit te snijden. Gebruik opnieuw hetzelfde type scheermesje en snijd simpelweg door verticaal naar beneden in de PDMS te drukken totdat u de bodem van de Petrischaal raakt.

Nu is de oriëntatie van de stempel iets waar we op moeten letten. Het stampoppervlak is de zijde van de PDMS die tegen de bodem van de Petri-schaal is gegoten, zodat deze vlak blijft. In dit grote vierkant PDMS dat ik heb uitgesneden, bevindt het stampoppervlak zich dus aan de bovenzijde.

Deze stempel is nu veel groter dan de M-pads, dus ik ga hem weer terugbrengen naar de grootte van één enkele M-pad door te snijden met het scheermesje. Omdat het erg moeilijk is om de juiste oriëntatie van de stempel met het blote oog te bepalen, maak ik een klein inkeping aan de zijde die de achterkant van de stempel wordt, oftewel de niet-stempelzijde, precies zoals dit. Vervolgens kan ik de stempel uit de grotere plaat verwijderen. Ik heb nu een A-P-D-M-S-stempel voor de volgende stap.

We willen de PDMS-stempels reinigen. Aangezien het zeer waarschijnlijk is dat er tijdens het uitsnijden van de stempels stof uit de atmosfeer op de PDMS-stempels is neergekomen, voeren we dit proces uit waarbij we het gewenste aantal PDMS-stempels in deze crystallisatie-schaal plaatsen en de schaal vullen met 100% ethanol.

Voeg vervolgens voldoende ethanol toe om het oppervlak van de stempels te bedekken, waarbij de exacte hoeveelheid toegevoegde ethanol niet van belang is. Plaats daarna de kristallisatieschijf in een bad en soniceer de stempels gedurende vijf minuten. Na deze vijf minuten voltooien we de sterilisatie van de stempels en voeren we de rest van de microcontactdrukmethode uit, namelijk de functionalisering van de M-pads, in een steriele weefselkweekkap.

We bevinden ons nu in de weefselkweekkap, waar we de stempels verder kunnen steriliseren. Hiervoor halen we de stempels uit de crystallisatieschaal, dopen we ze in een schaal met ethanol om eventuele resterende resten weg te spoelen en dopen we ze tot slot in een schaal met water om de ethanol te verwijderen. Vervolgens drogen we de stempels met een stroom stikstof totdat er geen zichtbare druppels meer achterblijven.

De volgende stap is het inkten van de stempels met een eiwitoplossing. De eiwitoplossing die we gebruiken is 50 µg/mL fibrine in DEI-water. Neem simpelweg wat van de eiwitoplossing op met de pipet en breng druppels van de eiwitoplossing aan op het stempeloppervlak.

U doet dit door kleine druppeltjes op de rand van het stempeloppervlak aan te brengen. Herhaal dit eerst voor alle stempels die u gaat gebruiken; dit had ik vooraf al moeten doen. De volgende stap, nadat u druppels op de randen van alle stempels heeft geplaatst, is om deze druppeltjes met elkaar te verbinden en het stempeloppervlak te vullen met de eiwitoplossing.

De reden waarom we dit doen, is omdat de eiwitoplossing in de druppels en de vloeistof onder de druppels het stampoppervlak hydrofiel maken, waardoor het extracellulaire matrixeiwit gemakkelijker kan verspreiden. Herhaal dit dus voor alle stamps die u gebruikt. Nu we de eiwitoplossing over het oppervlak van de stamps hebben verspreid, is de laatste stap bij het inkten van de stamps om ervoor te zorgen dat de randen bedekt zijn. Hiervoor houden we simpelweg een pipet in een hoek en laten we deze langs het stampoppervlak lopen, zodat er contact ontstaat met zowel de hoek van de PDMS-stamp als de eiwitoplossing.

Herhaal deze handeling vervolgens voor alle randen van alle stempels die u inkt. Nu het inkten van de stempels is voltooid, plaatsen we de stempels en laten we deze één uur in de weefselkweekkast staan om de volledige absorptie van het eiwit op het stampvlak te faciliteren. Nu we één uur hebben gewacht zodat de eiwitten op het stampoppervlak kunnen absorberen, is het tijd om ze af te spoelen met water en droog te blazen met stikstof.

Om dit te doen, nemen we steriel water en gieten we het steriele water in de schaal met de stempels. Pas op dat u het water niet rechtstreeks op het stempeloppervlak giet; indien nodig kunt u een pipet gebruiken. De exacte hoeveelheid water is niet belangrijk, zolang het waterniveau maar boven de eiwitoplossing komt.

Neem daarna met een steriele pincet één stempel, dip deze in een nieuw schaaltje water en blaas hem voorzichtig droog met stikstof. Ook nu weet u dat de stempel droog is wanneer u geen druppels eiwitoplossing meer op de stempel ziet. Herhaal dit voor alle stempels die u één voor één verwerkt.

Nu we de stempels droog hebben gespoeld, is het tijd om de mpad-substraten te activeren door ze te behandelen met UV-ozon. Ik verwijder het deksel van de Petrischaal. Omdat polystyreen UV-absorberend is, plaats ik de schaal vervolgens in de UV-ozonbehandelaar, sluit ik de lade, stel ik de tijd in op zeven minuten en start ik het proces.

We zijn nu terug bij de weefselkweekkast en het is tijd om de mpad-substraten, die zojuist met UV-ozon zijn behandeld, af te stempelen. Til hiervoor de gespoelde en gedroogde stempels op met een pincet. De stempels kunnen aan de zijkanten worden vastgepakt, maar raak het oppervlak van de stempel niet aan.

Pas de stempel in de pincet aan zodat de eiwitzijde toegankelijk is. Keer de pincet vervolgens om, waarbij u er rekening mee houdt dat de eiwitzijde naar beneden is gericht, en breng de stempel langzaam in contact met de eds. Stempel één tot 30 zijn behoorlijk plakkerig, dus mogelijk moet u een tweede pincet gebruiken om de stempel uit de pincet te laten loskomen.

U kunt de stempel vanuit een hoogte van ongeveer twee millimeter tot ongeveer acht millimeter op de emeds laten vallen. Kantel vervolgens het schaaltje met de emeds omhoog en druk voorzichtig aan met een pincet om contact te maken tussen de stempel en de eds. U kunt op een van de volgende twee manieren vaststellen wanneer er contact is gemaakt.

De eerste methode is om naar het ED-oppervlak te kijken via de zijkant van de stempel. Dit is mogelijk lastig op camera te zien, maar met het blote oog kan ik duidelijk zien dat de stempel contact maakt met het oppervlak door via de zijkant van de stempel naar het oppervlak te kijken. De tweede manier om contact te waarborgen met de p, is door de Petrischaal met het deksel erop uit de weefselkweekkast te halen en deze onder een omgekeerde microscoop te bekijken.

Door de interferentiepatronen met de microscoop te visualiseren, zou u moeten kunnen vaststellen of en wanneer de stempel in contact is met het substraat. Zodra het contact is vastgesteld, hoeft de stempel slechts enkele seconden met dit substraat in contact te blijven. Het is nu tijd om de stempel te verwijderen.

Vouw hiervoor de eds naar beneden met één pincet en pel de stempel in één vloeiende beweging los. Houd nauwkeurig bij welke eds u heeft gestempeld en welke stempels u al eerder heeft gebruikt. Herhaal deze procedure één keer per EMPA voor elk substraat dat u wilt gebruiken.

Nu we de EMPA's hebben gestempeld, is de volgende stap om ze te steriliseren en vervolgens te incuberen in een lipofiele kleurstof genaamd dye eye. Deze kleurstof is een lipofiel molecuul met een fluorescent label, waardoor het gedurende een bepaalde tijd in het PDMS diffundeert, wat ons in staat stelt om de postdeflecties onder de microscoop te visualiseren. Wat ik nu ga doen, is elk individueel EMPA-substraat één voor één nemen en onderdompelen in 100% ethanol, 70% ethanol, DI-water, DI-water, DI-water, DI-water.

En tot slot, een oplossing van dii van 5 µg/ml. De DII-oplossing is fluorescent, dus om de blootstelling aan omgevingslicht en fotobleking te minimaliseren, dekken we de schaaltjes af met aluminiumfolie terwijl ze gedurende één uur incuberen in de weefselkweekkast. Nu we één uur hebben gewacht zodat de EM-pads kunnen incuberen in de DAI-oplossing, kunnen we de aluminiumfolie verwijderen en de DAI-oplossing uitspoelen.

We spoelen het uit door drie opeenvolgende onderdompelingen in gesteriliseerd water en dompelen het vervolgens onder in een oplossing van 0,2%onic F1 27. Dat is 0,2% gewicht per volume. Tijdens alle onderdompelingsstappen is het belangrijk om de tijd dat de EM-pads aan de lucht worden blootgesteld te minimaliseren. Dit is om schade aan de ED-substraten te voorkomen en specifiek te voorkomen dat twee posts op elkaar instorten.

De 0,2%ige F1 27 is een triblokcopolymeer dat is samengesteld uit hydrofiele en hydrofobe domeinen. Het hydrofiele domein staat erom bekend eiwitabsorptie en bijgevolg celadhesie tegen te gaan, terwijl het hydrofobe domein bindt aan het hydrofobe PDMS. Wanneer PDMS dus wordt geweekt in F1 27, bindt de F1 27 aan het PDMS en wordt celadhesie afgestoten.

Na een uur incubatie in chronisch F1 27 in een met aluminiumfolie afgedekte Petrischaal, kunnen we het F1 27 uitspoelen door opeenvolgende onderdompelingen in steriel water, steriel water en PBS. Nadat de onderdompeling in PBS is voltooid en het product F1 27 is uitgespoeld, kunnen we de substraten vervolgens onderdompelen in een celkweekoplossing naar keuze. De celkweekoplossing waarin ik de EMPA's zojuist heb ondergedompeld, kan serum en/of andere groeifactoren en/of supplementen zoals penicilline en streptomycine bevatten.

Al deze ingrediënten zijn volledig compatibel met de EMPA-behandelingen. De volgende stap, zodra de eds in de celkweekoplossing zijn ondergedompeld, is het uitplaten van de gekozen cellen op de eds. Voor deze specifieke experimentele opstelling zal ik bovine pulmonale aortale endotheelcellen uitplaten in drie verschillende schaaltjes.

De reden waarom ik drie verschillende schaaltjes gebruik, is dat ik twee van de schaaltjes zal behandelen met bekende tactiliteitsremmers om de afbuiging van de posts te remmen, zodat we dit op een later tijdstip kunnen analyseren. Om de cellen uit te zaaien, neem ik simpelweg mijn celsuspensie, zuig ik de juiste hoeveelheid op met de pipet en pipetteer ik dit druppelgewijs in elk schaaltje. Ik voeg voldoende cellen toe zodat de cellen op de eds als individuele cellen aanwezig zijn wanneer ik de analyse uitvoer om de tractiekrachten te meten.

De hoeveelheid die u toevoegt, is afhankelijk van het spreidingsgebied en de groeisnelheid van uw specifieke cellen. Wij zaaien doorgaans tussen de 1500 en 5 000 cellen per vierkante centimeter substraat. Nadat u klaar bent met het zaaien van de cellen of het toevoegen van de celsuspensie druppelsgewijs aan de kweek, schudt u de kweekschaal voorzichtig enkele keren heen en weer in orthogonale richtingen om de celsuspensie in de kweekschaal te mengen.

Herhaal dit proces voor alle substraten die u gebruikt. Plaats de cellen direct na het uitzaaien in een incubator van 37 °C met een passend niveau van koolstofdioxide om de pH en het celcultuurmedium te bufferen. Ongeveer twee uur na het uitzaaien van de cellen is het raadzaam om de cellen te spoelen door de substraten over te brengen van één schaal met medium naar een nieuwe schaal met hetzelfde celcultuurmedium.

De reden voor deze spoeling is dat de meeste cellen na twee uur zijn begonnen met uitspreiden en bijna hun uiteindelijke spreidingsareaal hebben bereikt. Door de cellen en de substraten te spoelen, verwijdert u alle zwevende cellen uit het celkweekmedium. Op die manier zullen alleen de cellen die aan de EDS zijn gehecht en het spreidingsproces zijn gestart, zichtbaar zijn bij de eindmeting van de tractiekrachten.

Een assay die we kunnen uitvoeren met cellen die op MPA's zijn gekweekt, is time-lapse imaging om de dynamiek van de cellulaire contractiliteit kwantitatief te onderzoeken. In het bijzonder is de dynamiek van de cellulaire contractiliteit als reactie op oplosbare factoren interessant. Oplosbare factoren, zoals biologische en synthetische verbindingen, staan erom bekend de cellulaire contractiliteit te verhogen, te verminderen of onbekende effecten daarop te hebben.

Voor dit levende cel-experiment gebruiken we deze geïnverteerde epi-fluorescentiemicroscoop. Op de microscooptafel heb ik een kleine incubatiebox geplaatst die is aangesloten op een temperatuurregelaar om de temperatuur op 37 °C met 5% CO2 te houden. We zullen beelden opnemen bij een hoge vergroting met een 60 x plan APO objectief.

Nu gaan we het impactsubstraat voor beeldvorming voorbereiden. Het 60 x objectief dat we gebruiken voor de beeldvorming heeft een werkafstand van 200 microns, wat veel dunner is dan de dikte van de weefkweekschaal waarin we eerder de cellen hebben gezaaid. Daarom kunnen we de cellen op de implantaten in de weefkweekschaal niet afbeelden.

Om dit probleem te omzeilen, gebruiken we deze schaaltjes met glazen bodem. Ik zal nu het substraat ondersteboven in het schaaltje met glazen bodem overbrengen, zodat de cellen en de uiteinden van de pilaren zich op de interface van de glazen bodem van het schaaltje bevinden. Wanneer dit op de microscoop wordt geplaatst, is de werkafstand tussen de cellen en het objectief daarom minder dan 200 microns.

Nu zijn we klaar om dit onder een microscoop te plaatsen voor beeldvorming. Ik open nu de kamer van de live-cell incubator, plaats de sample erin en sluit het deksel van de incubatiekamer. Op dit punt zal ik het substraat scannen op zoek naar een geschikte cel.

Om beelden te maken. De meest efficiënte manier om dit te doen is door gebruik te maken van een fasecontrastobjectief van 10×, waardoor ik een breder veld van het substraat kan zien en sneller een cel kan vinden. Mijn criterium voor een goede cel is dat het om een enkele cel gaat.

De cel mag geen contact hebben met naburige cellen en moet een gemiddelde grootte hebben in vergelijking met alle andere cellen op het substraat; ik heb een geschikte cel gevonden om te bestuderen. De volgende stap is het wisselen naar het 60 x objectief om de cel bij een hoge vergroting te bekijken. Hiervoor defocussen we het objectief, zodat de tafel tijdens het draaien niet wordt geraakt.

Open de kamer terwijl u de revolver draait en roteer het 60 x objectief gedeeltelijk. Het 60 x objectief is een olie-immersielens, dus we moeten een druppel immersie-olie op de objectieflens aanbrengen. Nu maken we de rotatie van de revolver af om het 60 x objectief in positie te brengen. We sluiten de incubatiekamer en stellen het objectief opnieuw scherp om de cel weer in focus te brengen.

Zodra ik de positie en focus van de cel heb geoptimaliseerd, schakel ik over naar de CCD-camera om de cel op het computerscherm te kunnen bekijken en vervolgens de time-lapse imaging te starten. Voor dit experiment verzamel ik zowel fase- als fluorescentiebeelden met een interval van één minuut. De time-lapse imaging is nu gestart; ik laat dit 10 minuten lopen, wat overeenkomt met 10 frames, waarna ik serum zal toevoegen. Er zijn nu 10 minuten verstreken. Op dit moment open ik de kamer en voeg ik serum toe aan de schaal om de contractiliteit in de cel te stimuleren.

De timer loopt nog, dus ik moet hier snel mee zijn. We zullen nu de cel gedurende 30 minuten blijven filmen om eventuele veranderingen in de contractiliteit te volgen. Nadat de time-lapse imaging is voltooid, kunnen de beelden worden samengevoegd tot de getoonde film. Hier zijn twee films van de fasecontrast- en fluorescentiebeelden.

Links is een fasecontrastfilm van een grotendeels transparante cel, omlijnd in het zwart. De cel is uitgespreid over de uiteinden van 20 posts, wat de cirkelvormige structuren zijn die in een rechthoekig rooster zijn gerangschikt. Rechts is een fluorescentiefilm van dezelfde cel, maar hierbij zijn alleen de posts zichtbaar.

Wanneer ik deze video's afspeel, zult u zien dat de palen die aan de cel zijn bevestigd in eerste instantie zwak zijn, afbuigen en nauwelijks afwijken van het rechthoekige rooster. Halverwege de video heb ik serum aan het medium toegevoegd. Het serum stimuleert de cel om de contractiliteit te verhogen.

Naarmate de cel grotere tractiekrachten uitoefent op de onderliggende palen, beginnen de palen langs de omtrek van de cel naar binnen te buigen. In de fluorescentievideo is nu te zien dat palen aanzienlijk afwijken van hun posities in het rechthoekige rooster. Zoals ik later zal beschrijven, kan de verplaatsing van deze palposities in deze beelden worden gebruikt om de tractiekrachten van deze cel te analyseren.

Voorheen hebben we gezien hoe we de mpad-substraten hebben gegenereerd en hoe we deze functionaliseren om cellen te kweken. Nu zult u hebben gemerkt dat ik de voltooide mpad-substraten in drie verschillende celkweekschalen heb geplaatst. De cellen zijn gedurende de nacht gegroeid, en wat ik nu ga doen is elke individuele celkweekschaal behandelen met een ander oplosbaar agens dat de contractiliteit op een bekende manier moduleert.

We kunnen vervolgens op kwantitatieve wijze de tractiekrachten meten die ontstaan na het fixeren van de cellen gedurende 30 minuten. Nadat de oplosbare factoren 30 minuten na het toevoegen van de contractiliteitsremmers zijn toegevoegd, is het tijd om de cellen te fixeren met paraformaldehyde om de huidige staat van de tractiekrachten vast te leggen. Hiervoor is het belangrijk om paraformaldehyde te gebruiken dat calcium en magnesium bevat, waarbij we paraformaldehyde gebruiken met een volumepercentage van 3,7%. De methode voor het onderdompelen van de substraten in paraformaldehyde is hetzelfde als de methode voor het onderdompelen van de substraten in de verschillende RIN's tijdens de functionalisatie.

Dat wil zeggen dat het belangrijk is om te voorkomen dat de substraten uitdrogen, aangezien dit kan leiden tot post-collaps. Nadat ik de substraten heb overgebracht, laat ik ze 20 minuten incuberen in paraformaldehyde. Na deze 20 minuten halen we de substraten uit de paraformaldehyde; nu de cellen zijn gefixeerd, kunnen we deze monsters verwerken voor standaard immunokleuring.

Om dit te doen, plaatsen we de substraten met de voorkant naar boven op de paraformaldehyde en pipetteren we voldoende PBS om het substraat te bedekken en onder de PBS te houden. Vervolgens spoelen we een substraat drie keer met PBS om eventuele paraformaldehyde die in de cultuur kan zijn achtergebleven te verwijderen. Na het drie keer spoelen van het substraat met PBS kunnen we het substraat overbrengen voor verdere immunokleuring.

Dit doen we door het substraat met een pincet vast te pakken en om te keren bij de eerste stap van de immunokleuring, namelijk het behandelen met een permeabilisatiemiddel. In dit geval gebruiken we 0,2% Triton X in PBS. De gebruiker kan echter elk permeabilisatiemiddel gebruiken dat het meest geschikt is voor hun behoeften.

We herhalen dit voor al onze substraten en op deze manier behandelen we de substraten tijdens het immunokleuringsproces. Na de immunokleuring worden de substraten gemonteerd op een standaard glazen objectglas van één bij drie inch, dat vervolgens kan worden verwerkt op elke epifluorescentiemicroscoop, of deze nu geïnverteerd of rechtopstaand is. Door de monsters te verwerken op een confocale microscoop, kunnen we scherpstellen op de onderkant van de kolommen om de onafgebogen, oftewel nulposities, te bepalen.

Vervolgens kunnen we scherpstellen op de uiteinden van de posts, nog een afbeelding van de posts maken en, door de bovenste afbeelding te vergelijken met de onderste, de deflecties van de posts meten en de tractiekrachten berekenen die de cellen hebben gegenereerd om dergelijke deflecties te produceren. Door dit proces voor veel verschillende cellen onder diverse condities uit te voeren, kunnen we de gegenereerde tractiekrachten in de verschillende condities met elkaar vergelijken. Nu we afbeeldingen van zowel levende als gefixeerde cellen hebben verzameld, is onze volgende taak het meten van de deflectie en het bepalen van de tractiekrachten in de cellen.

Om dit te doen, hebben we een computerprogramma in matlab geschreven. Dit zijn de drie afbeeldingen die we in deze analyse zullen gebruiken. De eerste afbeelding is een fase-afbeelding van de cel.

Dit is nuttig voor het identificeren van de locatie van de cel. De tweede afbeelding is een fluorescentiebeeld van de bovenkanten van de palen. We gebruiken deze afbeelding om de posities van de palen aan hun uiteinde te bepalen.

Zoals u kunt zien, zijn sommige van deze palen afgebogen en wijken ze af van het rechthoekige rooster waarin de meeste palen zich bevinden, zoals deze paal en deze paal. De derde afbeelding die we gebruiken is de basisafbeelding, die de positie van de palen vastlegt in een brandvlak dat door hun basis loopt.

Op dit niveau moeten zowel de afgebogen als de niet-afgebogen palen zich in hun rustpositie bevinden, de niet-afgebogen posities. In het rechthoekige rooster is te zien dat de palen die in de tweede afbeelding aan de basis waren afgebogen, zich nu in hun FL-positie bevinden. Deze afbeelding wordt gebruikt om de positie van de paal in de niet-afgebogen positie te bepalen.

Vervolgens laden we het MATLAB-programma, waarin we worden gevraagd om deze drie afbeeldingen te laden. Geef het bestand een naam. U ziet nu de fase-afbeelding.

We trekken een kader rond de plek waar de cel zich bevindt, zodat het programma weet welke posten geanalyseerd moeten worden. Het programma voert vervolgens intensiteitsmeting, drempelwaarde-bepaling en segmentatie van de uitgesneden afbeelding uit om de OID-coördinaten van de posten te bepalen. Links staan de gesegmenteerde afbeeldingen van posten uit de bovenste afbeelding, terwijl rechts de gesegmenteerde afbeeldingen van dezelfde posten uit de basisafbeelding staan.

Nadat de posities en OID-coördinaten zijn verkregen, kan het programma de verplaatsingsvectoren tussen de top en de basis van elke post bepalen. Deze verplaatsingsvectoren van de posts kunnen worden omgezet in krachtvectoren door ze te vermenigvuldigen met de veerconstante van de post. We kunnen deze cellulaire krachten op verschillende manieren analyseren, zoals de gemiddelde kracht per cel of de gemiddelde kracht per post.

Een nuttig resultaat is een quiver-plot waarmee we de ruimtelijke verdeling van krachten kunnen visualiseren. Dit is de cel die we zojuist hebben geanalyseerd en u ziet dat ik gele pijlen over de posts heb gelegd die correleren met de grootte van de kracht en in de richting van de kracht wijzen. Door dit proces van beeldanalyse te herhalen voor beeldsequenties, zoals die nodig zijn voor onze time-lapsefilm, kunnen we een temporele sequentie genereren.

Hier is een video van de cel die we met serum hebben gestimuleerd. Zoals u kunt zien, nam de contractiliteit van de cel toe zodra het serum werd toegevoegd, waardoor de palen nog verder werden afgebogen. Bovendien kunnen we de krachten kwantificeren voor een groter aantal cellen die aan verschillende condities zijn blootgesteld en vervolgens zijn gefixeerd en gekleurd, zoals geïllustreerd door deze quiver-plots die een cel behandeld met een controleverbinding tonen versus cellen behandeld met contractiliteitsremmers.

Zoals u kunt zien, zijn de krachtvectoren op de cel in de controlegroep groter in lengte en magnitude dan de krachtvectoren in de twee gevallen waarin contractiliteitsremmers werden gebruikt. We hebben hier veel materiaal behandeld om het substraatpad te beschrijven, van microfabricage tot monstervoorbereiding, experimentatie en analyse, om de veelzijdigheid van deze substraten aan te tonen.

We hebben twee verschillende assays beschreven, live-cell imaging en een assay met gefixeerde monsters, en we hebben analyses uitgevoerd op cellen die met beide assays zijn verkregen en quiver-plots en quiver-films getoond. Met dit krachtige instrument kan men diverse ruimtelijke en temporele analyses van de celcontractiliteit uitvoeren. Zoals u heeft gezien, put deze methode uit vele verschillende disciplines, waaronder microfabricage, fundamentele celbiologie, oppervlaktechemie, beeldanalyse en -verwerking, en vele anderen.

En juist omdat de methode is gebaseerd op verschillende engineeringtechnieken, kunnen parameters zoals de geometrie van de posts, de geïnduceerde oplosbare factoren en de methoden om postdeflecties te analyseren worden aangepast aan de behoeften van de gebruiker. Wij hopen dat de visuele demonstratie van deze methode, die we de afgelopen 20 tot 30 minuten hebben uiteengezet, kan dienen als uitgangspunt voor andere en diepere analyses naar de regulatie, functionele gevolgen en generatie van cellulaire attractiekrachten.