Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

Het algemene doel van deze procedure is om het effect van mechanische belasting op de proteolytische splitsing van individuele eiwitten op een hoogst parallelle en kosteneffectieve manier te bestuderen. In deze demonstratie wordt de splitsing van collageen door matrixmetalloproteïnase 1 onderzocht; in de eerste stap worden collageen-trimmers bevestigd aan het glazen dekglas van een flowcel, gevolgd door de bevestiging van magnetische kralen ter grootte van micrometers aan de individuele collageenmoleculen. De tweede stap bestaat uit het monteren van de flowcel in het magnetische pincet-apparaat en het controleren of aspecifiek gebonden kralen van het oppervlak van het dekglas zijn verwijderd.

Vervolgens wordt het protease aan de flowcellen toegevoegd. De laatste stap is het bepalen van de proteolysesnelheid door de loslating van de beads in real-time te monitoren. Door de loslatingssnelheden van de beads te meten bij verschillende proteaseconcentraties en krachten, is het mogelijk om standaard zoölogische kinetische parameters af te leiden met behulp van minimale hoeveelheden substraat en protease.

Bovendien biedt deze techniek unieke informatie over het effect van mechanische kracht op de snelheid van proteolyse en op de structurele veranderingen in het substraateiwit die gepaard gaan met klieving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals optische T-sporen en atoomkrachtmicroscopie, is dat deze techniek een hoge doorvoer heeft en kosteneffectief is. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de effectieve kracht op de proteolytische klieving van enkelvoudige eiwitten, kunnen de instrumentatie en technieken worden toegepast op een breed scala aan biofysische vraagstukken, waaronder het effect van kracht op eiwitvouwing en -conformatie.

Begin de voorbereiding van de flowcel door de dekglasjes te reinigen middels sonicatie. Plaats de dekglasjes in een klein glazen bakje dat groot genoeg is om ze te bevatten en dat in de sonicator past. Vul het bakje met isopropanol en soniceer gedurende 20 minuten in een sonicatiebad, verwijder vervolgens de isopropanol en spoel de dekglasjes grondig af met grote hoeveelheden gedeïoniseerd water.

Vul de container met water en sonicize gedurende 20 minuten. Droog de dekglasjes na de sonicatie met een stroom gefilterde, stofvrije lucht. Inspecteer de dekglasjes en gebruik alleen die welke vrij zijn van vlekken.

Vlam de dekglasjes voorzichtig enkele seconden lang om eventueel overgebleven stof en vocht te verwijderen door de dekglasjes door een gasvlam van een bunsenbrander te halen, waarbij u er op let dat het dekglasje niet vervormt door overmatige hitte. Deze stap verwijdert resterende oppervlakteverontreinigingen.

Gebruik vervolgens dubbelzijdige plakband om de twee dekglasjes aan elkaar te bevestigen. Knip eerst het plakband in stukken van ongeveer drie centimeter lang en 0,3 centimeter breed en breng het plakband aan op een dekglasje van 22 bij 40 millimeter, waarbij in het midden een kanaal van 1,6 centimeter vrijblijft. Gebruik een pipetpunt om voorzichtig op het dekglasje te drukken, zodat het plakband goed is hecht.

De magnetische pincetapparatuur is door dit laboratorium geconstrueerd met behulp van een aluminium L-beugel met een gaatje van één millimeter diameter en is gemonteerd op een verticale Z-translatortafel om de hoogte van de pincet te moduleren. Twee permanente neodymiummagneten werden aan de beugel bevestigd aan weerszijden van het gaatje om de gradiënt van het magnetische veld te creëren. Een correcte kalibratie van de magnetische val is essentieel voor deze procedure.

Om succes te garanderen, gebruiken we twee verschillende methoden zoals beschreven in deze sectie. Gebruik voor de kalibratie van de magnetische val eerder geprepareerd DNA van de Lambda-faag, gelabeld aan de 5'- en 3'-uiteinden met biotine en doxygen, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Om het DNA aan de flowcel te hechten, vult u de flowcel eerst met een anti-D oxygen-antilichaamoplossing en laat u het antilichaam gedurende 15 minuten aan het glasoppervlak hechten.

Breng vervolgens een BSA-oplossing aan in de flowcel om aspecifieke binding van DNA aan het oppervlak te voorkomen. Let op dat voor deze blokkeringsstap en alle daaropvolgende stappen het toegevoegde reagensvolume minstens tweemaal het volume van de flowcel moet zijn, wat in deze demonstratie 75 microliters is; incubeer de flowcel gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.

Nadat deze stap is herhaald, voegt u 50 pico molar gefunctionaliseerd lambda DNA toe en laat u dit 15 minuten lang hechten aan het dekglas; was vervolgens het overtollige DNA weg met één keer XPBS. Voeg ten slotte streptavidine-gecoate superparamagnetische beads toe en laat deze 15 minuten lang hechten aan het geïmmobiliseerde DNA. In deze demonstratie worden 2.8 micrometer beads gebruikt.

Was het overtollige aantal beads weg met één keer XPBS. Voer vervolgens de kalibratie van de magnetische pincetten uit door de permanente magneten naar een positie te verplaatsen die ver verwijderd is van het sample-oppervlak. Plaats daarna de voorbereide flowcel in de microscoop.

Plaats de permanente magneten in positie boven de flowcel. Kies het brandvlak van de gefunctionaliseerde Lambda DNA-beads door scherp te stellen op de beads, weg van beide glazen oppervlakken. Het juiste brandvlak is dat waarin de gewenste beads een helder centrum hebben.

Maak een video van de beweging van de kralen met een frequentie van meer dan 80 hertz gedurende 500 frames. Verplaats de magneet dichter naar het sample-oppervlak en neem bij elke positie een video van de beweging van de kralen op. Voor afstanden groter dan 5 mm dient dit in stappen van 1 mm te gebeuren voor afstanden tussen 1 en 5 mm.

Verplaats in stappen van 0,5 millimeter voor afstanden kleiner dan één millimeter, en in stappen van 0,25 millimeter. Volg voor elke dataset het centrum van de kraaltjes met behulp van een 2D Gaussische fit. Bereken de kracht via brownse fluctuaties zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Bevestig de nauwkeurigheid van de krachten door de krachtberekening te controleren via een power spectrum lineaire fit.

Om de afragefrequentie te bepalen, kan de relatie tussen de uitgeoefende kracht en de afragefrequentie worden gevonden in de tekst voorafgaand aan de bevestiging van het collageenpeptide aan de flowcellen; expressie en zuivering van het collageenpeptide en de MMP-1-eiwitten. Begin met het toevoegen van de anti-Myc-antilichaamoplossing aan de flowcel en incubeer dit gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om de anti-Myc aan het oppervlak van de flowcel te laten hechten. Blokkeer de flowcel om aspecifieke binding van eiwitten te voorkomen met 5 mg/mL BSA. Voeg 150 pM collageenpeptide toe en laat dit gedurende 45 minuten via de Myc-tag aan het antilichaam hechten.

Was het overtollige collageen weg met PBS-buffer voordat de 2,8 micrometer kralen aan de flowcel worden toegevoegd. Deze moeten met sterke magneten worden gescheiden van het strep-divid en de gecoate kraalensuspensie, en vervolgens worden geresuspendeerd in PBS. Dit proces dient drie keer te worden herhaald.

Deze stap is essentieel om de 2,8 micrometer kralen te laten binden aan het op het oppervlak geïmmobiliseerde collageenpeptide. Voeg vervolgens strep divid streptavidine-gecoate superparamagnetische kralen toe en laat deze gedurende 45 minuten hechten aan de collageenmoleculen. Zodra de flowcel is geassembleerd met collageenpeptide en magnetische kralen, wordt de flowcel in de magnetische val afgebeeld.

Bij een lage kracht is een subpopulatie van de kraaltjes soms zwak en aspecifiek aan het oppervlak gehecht. Het toepassen van een gematigde kracht zorgt ervoor dat deze kraaltjes worden losgemaakt. Voeg het geactiveerde enzym toe aan de flowcel.

In dit geval werd MMP1 vooraf geactiveerd door toevoeging van 3,5 mM PMA en drie uur lang geïncubeerd bij 37 °C. Zodra een flowcel opnieuw in het magnetische pincetapparaat wordt geplaatst, wordt een video opgenomen over een aantal gezichtsvelden, wat doorgaans resulteert in enkele honderden gehechte beads. Deze meting komt overeen met tijd gelijk aan nul.

Herhaal hetzelfde proces van het vastleggen van verschillende gezichtsvelden op regelmatige tijdstippen totdat alle beads loslaten of er geen verdere proteolyse meer waarneembaar is. De magnetische pincetten werden gekalibreerd voor beads van 1 µm en 2,8 µm. Door gebruik te maken van zowel de amplitude van de waargenomen brownse fluctuaties als de berekening van de roll-off frequentie bij variërende magneetposities in de geforceerde proteolyse-experimenten, kan het genormaliseerde aantal overgebleven beads worden uitgezet als functie van de tijd om de proteolyse-snelheid te bepalen.

Dit proces kan worden herhaald voor verschillende enzymconcentraties en krachten. Proteolysesnelheden zijn afhankelijk van de uitgeoefende kracht. De proteolysesnelheden werden bepaald bij 1 pN, 6,2 pN en 13 pN.

Het fractie aandeel ongebonden kralen bij meer dan 15 minuten blijft in verschillende experimenten ongeveer constant op 0,25. In ons geval stelde de assay ons in staat om de katalytische efficiëntie van MMP1 te meten als functie van de uitgeoefende kracht. Door de gegevens te analyseren, ontdekten we dat de collageen triple helix lokaal moet ontwinden voorafgaand aan de proteolyse.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze correct worden uitgevoerd in vijf tot zes uur. Het is belangrijk om te onthouden dat er ten minste 30 tot 50 beads per gezichtsveld nodig zijn om een goede statistische significantie van uw gegevens te verkrijgen. Vergeet niet dat PMA extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen, laboratoriumjassen en mondkapjes altijd moeten worden getroffen bij het uitvoeren van dit experiment.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de invloed van kracht op de proteolytische splitsing van enkelvoudige eiwitten kan worden gemeten met behulp van magnetische pincetten. Magnetische pincetten zijn een uitstekend instrument voor het begrijpen van biofysische experimenten met enkelvoudige moleculen. Deze techniek kan worden uitgebreid naar andere combinaties van proteasen en substraten.

Daarnaast kunnen soortgelijke technieken worden gebruikt om de structurele dynamiek van eiwitten te begrijpen, evenals om andere eiwitten te bestuderen die RNA en/of DNA binden of modificeren.