Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Het algemene doel van het volgende experiment is om optische trapping in combinatie met spinning disc confocale microscopie te gebruiken om interacties tussen gastheer en pathogeen in realtime waar te nemen. Dit wordt bereikt door eerst de betreffende pathogenen toe te voegen aan een kamerdeksglas. Vervolgens wordt een partikel geselecteerd en gevangen met de optische trap.

Ten slotte wordt het deeltje naar de betreffende cel geleid. Zoals hier te zien is. Optische trapping kan een effectieve methode zijn voor het beheersen van twee deeltjes om dynamische intracellulaire interacties te observeren.

Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden over interacties tussen gastheer en pathogeen op het gebied van infectieziekten en immunologie, waaronder wat het effect op fagocytose is wanneer volledige controle over de ruimtelijke relaties tussen gastheercellen en pathogenen wordt verkregen, en of de volgorde waarin pathogenen door een fagocytische cel worden opgenomen de fagosomale rijping beïnvloedt. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de vangstcondities moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende cel- en kraaltypes. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het proces voor het opzetten en integreren van een spinning disc complex is.

Confocale uitlijning met een optische val is moeilijk te conceptualiseren vanwege de precieze uitlijning die vereist is voor alle optische componenten. Oogst het pathogeen van belang. In dit voorbeeld worden 300 µL van overnacht in bouillon gekweekte Candida albicans uit de cultuur gehaald en worden de pathogenen overgebracht naar een reactiebuis van 1,5 mL.

Was vervolgens de pathogenen drie keer gedurende vijf minuten bij ongeveer 1300 Gs op kamertemperatuur, waarbij telkens het supernatant wordt weggezogen en het pellet ongestoord blijft, resuspendeer in PBS en sonicize. Resuspendeer het pellet na de derde wasbeurt in 500 µL PBS. Los vervolgens één milligram van de kleurstof entrust op in 100 µL dimethylformamide voor een eindconcentratie van 10 mg/mL.

Voeg vervolgens drie µL van het kleurmengsel toe aan de reactiebuis met de gewassen pathogenen. Plaats folie rond de buizen aangezien de kleurstoffen lichtgevoelig zijn en schud het monster gedurende één uur bij 37 °C, om het monster daarna pelleten en drie keer wassen in PBS zoals eerder beschreven. Resuspendeer de pellet na de laatste wasbeurt in 300 µL PBS.

Warm het medium en PVS op tot 37 °C in een waterbad. Was een weefkweekplaat van 10 cm, gecoat met RAW 264.7 macrofagen, twee keer met PBS, waarbij het PBS tussen elke wasbeurt wordt weggezuigd. Bedek vervolgens het plaatsoppervlak met 5 mL trypsine en incubeer de plaat gedurende vijf minuten bij 37 °C.

Tik vervolgens voorzichtig tegen de zijkant van de plaat om de cellen van het platoppervlak los te maken. Wees zorgvuldig om te voorkomen dat de trypsine buiten de plaat spat. Voeg nu vijf milliliter medium toe aan de plaat en breng het mengsel over naar een reactiebuis.

Na het pelleten wordt het medium afgezogen, waarbij men er voorzichtig op let de pellet niet te verstoren, waarna de pellet wordt geresuspendeerd in 10 milliliters medium. Voeg 400 microliters medium toe aan elke kamer van een chamber slide en voeg vervolgens vijf microliters van de cel-suspensie toe aan elke kamer. Laat de cellen overnacht groeien in een incubator bij 37 degrees Celsius met 5%CO2.

Haal de chamber slide uit de incubator en pipetteer 5 tot 10 µL van de eerder voorbereide fluorescent gelabelde pathogenen van belang in elke kamer met macrofagen. Meng de macrofagen en pathogenen grondig door herhaaldelijk te pipetteren, waarbij u er zorg voor draagt dat u de bodem van de kamer niet raakt om de gehechte macrofagen niet te storen. Schakel alle componenten van de spinning disc confocale microscoop in.

Bereid de microscoop voor door olie aan de olie-immersieobjectief lens toe te voegen. Plaats de chamber slide in de gespecialiseerde tafel en verwijder vervolgens de bovenkant van de chamber slide; stel de microscoop af voor DIC-beeldvorming. Zet de sluiter voor de optische val en de IR-laser aan.

Open vervolgens de sluiter van de laser naar de optische pincet. Bevestig met de IR-kaart dat de sluiter voor de IR-laser gesloten is. Focus nu op de macrofagen op de gehecht slide.

Zoek vervolgens de pathogenen die vrij in de oplossing vlak naast de macrofagen zweven. Het moeilijkste deel van deze procedure is het vinden van het juiste object om in de monsterkamer te volgen, vanwege de adhesiekrachten tussen het object en het dekglas in de monsterkamer. Om dat object te verplaatsen, moet u de tafel bewegen terwijl het object door de trap-laser wordt vastgehouden; het is daarnaast belangrijk om op te merken dat u de tafel met een voldoende lage snelheid moet bewegen, zodat de sleepkracht van de tafel de maximale vangkracht van de trap niet overschrijdt.

Verplaats de tafel zodanig dat het pathogeen zich in de nabijheid van de val bevindt. Open vervolgens het sluiter en activeer de val. Verplaats het monster om de macrofagen in contact te brengen met een stationair gevangen beeld van het pathogeen.

De pathogenen werden met een spinning disc confocale microscoop afgebeeld, gebruikmakend van DIC, fluorescentie of een combinatie van beide. Aparte populaties van Canada albicans, die doorgaans ongeveer vijf micron groot zijn, werden groen, blauw en rood gelabeld. Om de beeldvorming te illustreren, werd één enkele C albicans gevangen en in een vierkant patroon door een cluster van andere gisten bewogen, zoals aangegeven door de grijze pijlen; dit demonstreert het vermogen om de specifieke locatie van een door de operator gekozen enkel pathogeen vast te leggen en te manipuleren, zelfs in een dichtbevolkte omgeving. Om de flexibiliteit van dit systeem om de verschillende vormmorfologieën van pathogene organismen in deze figuur vast te leggen verder te illustreren, werd de optische pincet gebruikt om een C albicans-deeltje met een pseudo hypha vast te houden en te positioneren.

De C albicans is gelabeld met rode kleurstof en bewoog zich langs een traject zoals aangegeven door de witte pijl en werd naast fluorescerende GFPL C3-ruwe cellen geplaatst. In het groen. Het gistgedeelte van de albicans bleef vastzitten terwijl de pseudohyfe meesleepte.

Aspergillus fumigatus werd eveneens naast een rauwe muismacrofaagcel geplaatst om het absolute tijdsverloop van fagocytose met deze specifieke cellijn en pathogeen te analyseren. In deze figuur laten helderveldbeelden zien hoe de gevangen aspergillus, aangegeven door de witte pijl, werd verplaatst en gepositioneerd langs het pad dat door de rode pijl wordt aangegeven. De gevangen pathogeen is enigszins buiten focus omdat de val het organisme iets boven het brandvlak duwt.

Aspergillus werd verplaatst tot het zich naast de gewenste ruwe cel bevond. Zodra het pathogeen contact maakte met de cel, werd de val uitgeschakeld. Het fagocytoseproces werd geactiveerd en er werd gebruikgemaakt van time-lapse imaging om de daaropvolgende cellulaire gebeurtenissen te observeren.

Na 30 seconden begon het membraan van de ruwe cel te veranderen en een cupje rond het partikel te vormen. Na 60 seconden was het cupje volledig gevormd. Tussen 90 en 150 seconden werd de Afu Gotti omsloten en tegen 180 seconden was het partikel volledig geïnternaliseerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een optische val met een draaiende schijf kunt creëren, en hoe een dergelijk instrument het mogelijk maakt om pathogenen niet-invasief te controleren voor live-cell imaging na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van gastheer-pathogeeninteracties om de rol van ruimtelijke relaties tussen gastheercellen en pathogenen te onderzoeken, en de invloed hiervan op de daaropvolgende immuunrespons.