Gebruik van de EpiAirway Model voor het karakteriseren van op lange termijn gastheer-pathogeen interacties

Het algemene doel van het volgende experiment is het uitvoeren van een langdurige co-cultuur van niet-typeerbare Hemophilus influenzae of NTHI met primaire menselijke respiratoire epitheelweefsels met behulp van het epi-luchtwegmodel. Dit wordt bereikt door het apicale oppervlak te inoculeren met NTHI, zodat de bacteriën in een tweede stap aan de weefsels kunnen hechten en deze kunnen binnendringen. De inserts worden elke 24 uur gewassen met voorverwarmde DPBS om de normale mucusstroom na te bootsen en om mucine-afvalproducten en eventuele cellulaire debris te verwijderen.

Vervolgens worden de weefsels op het gewenste tijdstip geoogst en wordt de overleving van zowel de totale cel-geassocieerde als de geïnternaliseerde NTHI bepaald. Ten slotte kunnen met deze methode stam-specifieke kenmerken van de overleving van NTHI in de weefsels over een bepaalde tijd worden geëvalueerd op basis van aantallen levensvatbare bacteriën. Deze methode kan inzicht bieden in langetermijninfecties met nontypeable hemophilus influenza.

Het kan ook worden gebruikt bij de studie van andere menselijke pathogenen, zoals Moraxella. Om deze procedure te demonstreren, heeft Dr. Doin, een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium, de handelingen uitgevoerd. Verwijder de transportplaat uit de verpakking en bereid het experiment voor. Spray de transportplaat in met 70% ethanol en plaats de plaat in de biologische veiligheidskast.

Verdeel één milliliter onderhoudsmedium voor epi-luchtwegen bij vier graden Celsius over elke put van een six-well plaat. Verwijder vervolgens de tape, open de plaat en haal het gaas dat de epi-luchtweginzetten bedekt weg. Gebruik een draaibeweging met een pincet om een inzet uit de houder te verwijderen.

Plaats de insert in een van de wells van de zes-wells plaat. Indien nodig, gebruik een steriel wattenstaafje om voorzichtig de iris uit de insert te verwijderen, waarbij contact met het membraan wordt vermeden. Controleer of er geen luchtbellen onder de inserts zijn ingesloten.

Plaats vervolgens de zeswellsplaat in een incubator. Was de inserts dagelijks als volgt: verwarm DPBS met calcium en magnesium voor en vul een pipetpunt met de DPBS. Pak vervolgens met een steriele pincet voorzichtig een insert op en pipetteer 200 µL van de voorverwarmde DPBS op het weefsel.

Schud vervolgens het inzetstuk voorzichtig heen en weer om de DPBS gelijkmatig te verdelen zonder het weefsel aan te raken. Kantel daarna het inzetstuk onder een hoek en plaats een P 1000 pipetpunt tegen de plastic ring die het membraan aan de onderkant van het inzetstuk vasthoudt. Aspireer vervolgens voorzichtig de buffersolution en breng de oplossing over in een cryobuis voor latere analyse.

Aspireer ten slotte het basale onderhoudsmedium en vervang dit door één milliliter vers medium. Verwarm meer DPBS met calcium en magnesium voor. Voeg drie milliliter van de voorverwarmde DPBS toe aan een buis van 15 milliliter en resuspendeer vervolgens enkelvoudige kolonies van niet-typeerbare influenza of NTHI die gedurende de nacht op chocoladeagar zijn gegroeid in de buis.

Vortex de buis nu krachtig gedurende ten minste 10 seconden en meet vervolgens de optische densiteit. Voeg telkens enkele kolonies NTHI toe totdat de bacteriële concentratie een OD 600 nanometers van ongeveer 0,7 bereikt. Was daarna elke EPI-luchtweginsert met voorverwarmde DPBS zoals voorheen, en voeg vervolgens 28 µL van de bacteriële suspensie toe aan het apicale oppervlak van elke insert.

Voorkom dat het basale onderhoudsmedium wordt geïnoculeerd. Plaats de plaat vervolgens terug in de incubator om de NTHI te kwantificeren; verwarm eerst voor en droog daarna de chocolade-agarplaten aan het oppervlak. Verdun vervolgens het NTHI-inoculum seriële door gebruik te maken van steriele PBS met 0,1% gelatine of PBSG.

Breng aliquoten van 10 µL van het inoculum aan op de platen en incubeer de platen vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C in 5% koolstofdioxide. Bepaal de volgende dag de CFU's per milliliter door de verdunning te tellen die 15 tot 30 duidelijke kolonies per druppel bevat, en bereken op basis hiervan het werkelijke levensvatbare inoculum van NTHI om de totale hoeveelheid celgeassocieerde bacteriën te oogsten. Spoel het apicale oppervlak van de epi airways drie keer af met 200 µL DPBS zonder calcium of magnesium.

Kantel vervolgens de insert en spoel eventuele resterende onderhoudsmedia van het basaalmembraan. Plaats de gewassen insert in een schone zeswellplaat en voeg 250 µL steriele, 1% saponine-oplossing toe aan het apicaal oppervlak van elk weefsel. Plaats de plaat gedurende 10 minuten terug in de incubator terwijl de plaat wordt geïncubeerd.

Bereid buisjes voor voor seriële verdunning door elk verdunningsbuisje te vullen met 900 µL PBSG. Schraap vervolgens het weefsel van het membraan met een P 1000 pipetpunt door middel van een heen-en-weergaande beweging, gevolgd door een cirkelvormige beweging om het weefsel van de randen van de insert te verwijderen. Plaats vervolgens de suspensie met een steriele P 1000 pipetpunt met een grote boring in een leeg eppendorferbuisje van 1,5 ml.

Voeg nu 250 µL DPBS toe aan het apicale oppervlak van de insert en onderzoek de insert vervolgens met een omgekeerde fasecontrastmicroscoop om te bepalen of er nog weefsel geoogst moet worden. Voeg de suspensie toe aan de einor-buis en vul deze aan met 500 µL DPBS onder krachtig mengen. Vortex de celsuspensie gedurende één minuut.

Zuig vervolgens de suspensie via de naald op in een steriele spuit van 1 ml met een naald van 26 gauge. Duw de suspensie langzaam driemaal door de naald, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan.

Vortex vervolgens de suspensie nogmaals een minuut krachtig. Gebruik daarna een pipetpunt met een grote opening om 100 µL van de suspensie over te brengen naar de eerste verdunningsbuis. Vortex de buis vijf seconden krachtig en maak vervolgens een seriële verdunningsreeks van 1 tot 10, waarbij de verdunningen op chocolade-agarplaten worden geplaatst.

Incubeer de platen vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C in 5% CO2 om levensvatbare bacteriën te tellen en de geïnternaliseerde bacteriën te oogsten. Was elk insert slechts drie keer met 200 µL DPBS. Vervang het basale onderhoudsmedium door medium dat 100 µg/mL gentamycine-sulfaat bevat, en voeg vervolgens 300 µL van dit onderhoudsmedium met gentamycine toe aan het apicale oppervlak.

Plaats de inserts voor één uur terug in de incubator; verwarm tijdens het incuberen van de inserts wat DPBS voor. Verwijder vervolgens het onderhoudsmedium met gentamicine van het apicale oppervlak. Was daarna het apicale oppervlak en het basale membraan van de inserts grondig met de voorverwarmde DPBS.

Herhaal ten slotte de zojuist gedemonstreerde procedure voor het scrubben en oogsten voordat er seriële verdunningen worden uitgevoerd en de geïnternaliseerde bacteriën in deze figuur worden geplaat. Vergelijking van scanning elektronenmicroscoopbeelden van niet-geïnfecteerde epi-luchtwegweefsels links met vijfdaags NTHI-geïnfecteerde epi-luchtwegweefsels rechts. Er is te zien dat langdurige co-cultuur met NTHI niet leidt tot significante schade aan de apicale weefsels, wat het nut van het epi-luchtwegmodel onderstreept.

Hier wordt een grafiek getoond die het aantal geïnternaliseerde NTHI in de loop van de tijd tijdens een epi-luchtweg co-cultuur weergeeft. De R 2 8 6 6 stam werd geïnoculeerd met ongeveer 1 × 10⁷ CFU per insert. Vervolgens werden de geïnternaliseerde bacteriën geoogst en geteld op elk aangegeven tijdstip.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u langdurige co-cultuur van NTHI met primaire hormonale respiratoire weefsels kunt uitvoeren met behulp van het A PRE-model.