Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Het algemene doel van het volgende experiment is om verschillende virologische en biochemische benaderingen te gebruiken om de rol van een signaleringspad van de gastheer te ontleden bij de lytische replicatie van een modelherpesvirus. Hieronder onderzoeken we als voorbeeld de rol van het mitochondriale antivirale signaleringsproteïne Mavs tijdens infectie met het herpesvirus gamma HV 68. Om eerst de rol van Mavs tijdens een acute infectie te onderzoeken, worden wild-type en Mavs-knockout muizen geïnfecteerd met gamma HV 68 na een acute virale infectie.

De long van de muis wordt geoogst en de virale ladingen worden bepaald via een plaque-assay waarbij de monsters serieel worden verdund en geplaat. Vervolgens wordt het aantal plaques op de monolaag geteld. Verhoogde virale ladingen in de knockout-muizen suggereren dat het betreffende gen een antivirale rol speelt.

Daarentegen wijzen verlaagde virale ladingen in knockout-muizen erop dat het gen noodzakelijk is voor virale infectie. Om deze bevindingen te valideren, worden in vitro virale multi-step groeikinetieken onderzocht in embryonale muisfibroblasten; wild-type en mavs-knockout embryonale muisfibroblasten worden geïnfecteerd met gamma HV 68 en gedurende verschillende tijden geïncubeerd. De cellen worden vervolgens verzameld en er worden plaque-assays uitgevoerd om de multi-step groeikinetieken tussen wild-type cellen en mavs-deficiënte cellen te vergelijken.

Om deze bevindingen verder te valideren, worden embryonale fibroblastcellen van wild-type en mavs-knockout muizen geïnfecteerd met gamma HV 68. Vervolgens worden DNA en RNA afzonderlijk geëxtraheerd uit de geïnfecteerde cellen en worden de virale genomische transcripten geanalyseerd via real-time PCR. We kwamen oorspronkelijk op het idee voor dit protocol toen we de rol van een immuunroute van de gastheer bestudeerden tijdens een lytische virusinfectie.

Dit protocol kan potentieel worden toegepast om de regels van gastheersignaleringspaden tijdens infectie door andere pathogenen te onderzoeken. Begin deze procedure door zes tot acht weken oude, geslachtsmatchende nestgenoot-muizen vier dagen te laten acclimatiseren na verzending. Het volgende experiment zal worden uitgevoerd in een biohazard-faciliteit.

Trek ter voorbereiding persoonlijke beschermingsmiddelen aan, waaronder een laboratoriumjas, handschoenen, een masker en overschoenen, en werk in een biosafety cabinet klasse II. Bereid de virale suspensie voor met 40 tot 10.000 PFU gamma HV 68 en 30 µL steriele PBS voor elke muis die geïnfecteerd zal worden.

Houd de virale suspensie op ijs na een intraperitonele injectie van ketamine Xylazine. Controleer of de muizen gesedeerd zijn door een knijptest bij de teen uit te voeren. Breng vervolgens met een pipet 30 µL van de virale suspensie druppelgewijs aan in het linker- of rechterneusgat.

Leg de muis vijf tot 10 minuten op zijn zij om de toediening van het virus via de luchtwegen in de longen te vergemakkelijken. Plaats de muizen vervolgens terug in hun kooi en houd ze in de gaten tot ze volledig zijn hersteld van de sedatie. Daarna wordt longweefsel verzameld van de geïnjecteerde muizen om een cellysaat te bereiden voor het bepalen van de virustiter op verschillende dagen na infectie.

Plaats de longen die zijn geoogst van geofferde muizen in steriele schroefdoppenbuisjes van 1,5 milliliter met 500 µL zirconia-silicakralen van 1,0 mm op ijs. Indien de volgende stap niet op dezelfde dag wordt uitgevoerd, dienen de monsters te worden bewaard bij -80 °C.

Voeg anders één milliliter koud serumvrij DMEM toe. Plaats de buis in een bead beater en druk op start om de longen 30 seconden lang te homogeniseren. Dit is om oververhitting van het monster te voorkomen, wat het virus zou kunnen inactiveren.

Koel de buis gedurende ten minste één minuut op ijs na 30 seconden homogenisatie. Herhaal dit proces vervolgens. Centrifugeer daarna het gehomogeniseerde weefsel bij 16 000 RCF bij vier graden Celsius gedurende één minuut.

Na het centrifugeren bevinden de celresten zich onderin de buis en de lipiden zich aan het oppervlak. Neem onmiddellijk het supernatant zoals hier getoond om een plaque-assay uit te voeren met behulp van een NIH 3T3- of BHK-21-monolaag. Vervolgens wordt een plaque-assay uitgevoerd om de virale titer in het monster te bepalen; begin de plaque-assay door seriële verdunningen van het virale supernatant te maken.

Voeg eerst met een meerkanaalpipet 270 µL medium toe aan een 96-wellsplaat. Laat de eerste rij ongebruikt. Voeg vervolgens 200 µL supernatant toe aan de eerste rij van de 96-wellsplaat; breng elke sample in drievoud over.

Breng vervolgens 30 µL van de sample uit de eerste rij over naar de volgende rij en meng. Breng daarna 30 µL van het mengsel over naar de volgende rij en meng. Herhaal deze stap meerdere keren om tienvoudige seriële verdunningen te maken.

Voeg vervolgens het verdunde virale supernatant toe aan de cellaag in een 24-wells plaat. Plaats de plaat in een incubator en schud de plaat elke 30 minuten gedurende een incubatie van twee uur. Aspireer na de incubatie het supernatant uit de plaat om celresten te verwijderen.

Was de cellen vervolgens eenmaal met vers medium. Voeg na het wassen medium met methylcellulose toe aan de cellen. Incubeer de cellen gedurende vier tot zes dagen.

Laat dit vier tot zes dagen passeren. Gebruik een microscoop om het aantal plaques voor elk monster af te lezen. Noteer het aantal plaques voor elke verdunning.

Bereken vervolgens het gemiddelde en de standaarddeviatie. Wells met te veel of te weinig plaques kunnen niet worden gebruikt om de titer nauwkeurig te berekenen. Gebruik daarom voor elk monster een verdunning waarbij er zeven tot 70 plaques aanwezig zijn.

Dit monster, 1000 keer verdund, heeft een gemiddelde van 23 plaques per putje. Om de virale titer in de onverdunde oplossing te berekenen, vermenigvuldigt u de verdunningsfactor met het aantal plaques en met het aantal microliters in een milliliter. Deel dit vervolgens door het volume verdund supernatant dat per putje is toegevoegd.

In dit voorbeeld is 1000 maal 23 plaques maal 1000 µL per milliliter gedeeld door 100 µL gelijk aan 2,3 × 10⁵ vormende eenheden per milliliter. Vervolgens wordt een virale stockoplossing met een bekende titer gebruikt om de groeikinetiek van gamma HV 68 in embryonale fibroblasten van muizen te bepalen. Begin met het uitplaten van wild-type muiscellen en cellen die deficiënt zijn voor een gastheergen in een 24-wellplaat bij 10.000 cellen per well. Vervang de volgende dag het medium in elke well door 0,5 mL van een gamma HV 68-suspensie met een lage MOI.

Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C en laat de incubatie twee uur lang doorgaan. Schud de plaat elke 30 minuten tijdens de incubatie. Gebruik een pipet om de virale suspensie te verwijderen en voeg 0,5 mL vers compleet DMEM met 8% foetaal runderserum toe aan de virus-geïnfecteerde cellen.

Plaats de cellen op verschillende dagen na de infectie terug in de incubator. Oogst het medium en de cellen door meerdere keren op en neer te pipetteren. Draag ze over naar steriele centrifugebuisjes van 1,5 milliliter en vries de buisjes onmiddellijk in bij -80 °C om gamma HV 68 uit de Mets vrij te maken.

Voer drie vries-dooi-cycli uit. Ontdooi de cellen door ze bij 37 °C te plaatsen. Vortex vervolgens en plaats ze terug in de vriezer bij -80 °C.

Bepaal de virale titer via een plaque-assay met gebruik van een NIH 3T3- of BHK-21-monolaag, zoals eerder beschreven, om te onderzoeken of de DNA- of RNA-replicatie wordt beïnvloed door deficiëntie in gastheergenen of virale genen. Begin met geïnfecteerde cellen op verschillende dagen na infectie, verwijder het supernatant, spoel de cellen met koud PBS en trypsiniseer de cellen op ijs. Pelleteer vervolgens de cellen door centrifugatie bij 1000 RCF bij kamertemperatuur gedurende één minuut; verwijder na het centrifugeren het supernatant en bewaar de cellen bij -80 °C.

Extraheer totaal DNA en RNA, afkomstig van zowel de gastheer als het virus. Centrifugeer vervolgens de spin-kolommen. Voer real-time PCR uit met behulp van het totale DNA en primers die specifiek zijn voor virale lytische transcripten.

Bepaal de relatieve hoeveelheid van het intracellulaire gamma HV 68-genoom ten opzichte van een housekeeping-gen van de gastheer, zoals bèta-actine. Bereid cDNA voor met totaal RNA en oligo-dT-primers. Voer real-time PCR uit met het cDNA en primers zoals hierboven beschreven om de relatieve hoeveelheid virale transcripten te bepalen.

In referentie tot dat van het housekeeping-gen van de gastheer staat Mavs hier voor mitochondrial antiviral signaling. Het Mavs-adaptermolecuul geeft signalering door van cytosolische rig-eye-like receptoren om NF kappa B en interferon-regulerende factoren (IRFs) te activeren, die op hun beurt de genexpressie van pro-inflammatoire cytokinen en interferonen opreguleren. De virale ladingen in de longen van wild-type muizen geïnfecteerd met gamma HV en de nestgenootmuizen die deficiënt zijn voor Mavs worden hier getoond.

Een tekort aan Mavs verminderde de virale last in de longen op 10 dagen na infectie aanzienlijk, wat aangeeft dat Mavs vereist is voor een efficiënte virale infectie in vivo. Deze figuur toont een virale groeicurve over meerdere stappen op embryonale fibroblasten van wilde-type muizen en fibroblasten met een Mavs-deficiëntie. De virale groei op embryonale fibroblasten van muizen was significant vertraagd, wat aantoont dat Mavs vereist is voor efficiënte virale replicatie in vitro. De mRNA-niveaus van virale lytische genen in met gamma HV 68 geïnfecteerde embryonale fibroblasten van muizen werden geanalyseerd via real-time PCR; een tekort aan Mavs verminderde de mRNA-niveaus van drie essentiële lytische genen significant.

Al deze resultaten ondersteunen gezamenlijk de conclusie dat Mavs vereist is voor de transcriptieactivatie van gamma HV 68 en voor lytische replicatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de interactie tussen gastheer en pathogeen op meerdere niveaus kunt onderzoeken, zowel in VO als Vevo. Vergeet niet dat het werken met pathogenen uiterst risicovol kan zijn.

Tijdens de uitvoering moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen.