Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie

Deze video demonstreert een procedure voor het scheiden van gemengde virale assemblages op basis van hun nucleïnezuurcompositie. Dit maakt het mogelijk om de taxonomische diversiteit en het functionele potentieel van complexe virale assemblages te bestuderen. Hierbij wordt hydroxyapatiet, een kristallijne vorm van calciumfosfaat, gebruikt voor de scheiding van nucleïnezuren.

Eerst wordt een hydroxyapatietkolom gepakt en geëquilibreerd, waarna gezuiverde virale nucleïnezuren op de kolom worden aangebracht; de ladingsinteractie tussen de positief geladen calciumionen van het hydroxyapatiet en de negatief geladen fosfaatruggengraat van de subtypes nucleïnezuren bindt de nucleïnezuren aan de kolom. Vervolgens worden enkelstrengs DNA/RNA en dubbelstrengs DNA sequentieel geëlueerd met verschillende concentraties fosfaatbuffer. De resulterende nucleïnezuren worden daarna ontzout en geconcentreerd ter voorbereiding op visualisatie, kwantificering en identificatie via DNA-sequencing. Agarosegelelektroforese bevestigt dat de nucleïnezuren gescheiden kunnen worden met minder dan 9% carry-over.

Zo maakt deze methode de evaluatie van de diversiteit en functionele capaciteit van virale gemeenschappen mogelijk. Hallo, mijn naam is Doug Fro en ik ben onderzoeker in het laboratorium van Dr. Shannon Williamson bij het j Craig Venture Institute. Vandaag laat ik u een procedure zien om enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA te scheiden uit een milieu-virale assemblage.

Deze methode biedt voordelen ten opzichte van bestaande methoden, zoals de behandeling met de kern, die zich richt op ofwel DNA of RNA. Hydroxyapatiet-chromatografie is in staat om de gehele virale gemeenschap vast te leggen. Deze methode stelt ons in staat om verschillende vragen op het gebied van virale ecologie te beantwoorden.

Bijvoorbeeld, wat is het totale gencomplement of de diversiteit van de virale gemeenschap? We dachten eerst aan deze methode toen we de volledige Rio Plankton-assemblages uit de Chesapeake Bay wilden bestuderen zonder een subset van de genetische signatuur op te offeren. De oplossingen die nodig zijn voor dit experiment moeten vooraf worden bereid volgens de instructies in het bijbehorende geschreven protocol en omvatten 0,12 molar fosfaatbuffer, 0,20 molar fosfaatbuffer, 0,40 molar fosfaatbuffer en een een molar fosfaatoplossing.

Zorg dat alles op pH 6.8 is en dat het gehydrateerde hydroxyapatiet op de dag van het experiment is voorbereid; laat alle fosfaatbuffers en het gehydrateerde hydroxyapatiet equilibreren door ze in een waterbad van 60 graden Celsius te plaatsen. Begin deze procedure met het klaarmaken van de econo-kolom die zal worden gebruikt voor de scheiding van virale nucleïnezuren. Bevestig een stopkraan aan het uiteinde van de econo-kolom en zorg ervoor dat deze gesloten is.

Voeg met een pipet gedeïoniseerd water toe aan de kolom, plaats vervolgens de dop op de bovenkant van de kolom en keer de kolom herhaaldelijk om om deze te spoelen. Giet het water af en herhaal deze wasbeurt meerdere keren. Verwijder daarna de stopkraan uit de econ-kolom en autoclaveer deze om deze te steriliseren.

De stopkraan mag niet geautoclaveerd worden omdat deze zou smelten. Spoel de stopkraan eerst met gedeïoniseerd water, vervolgens opnieuw met 70% ethanol en laat deze na het autoclaveren aan de lucht drogen. Plaats de stopkraan terug en sluit deze.

Voeg vervolgens, terwijl u in een zuurkast werkt, één milliliter sigma coat toe aan de kolom en bekleed het glas van de kolom door de kolom met een rollende beweging om te keren, zoals hier wordt getoond. Het bekleden met sigma coat minimaliseert het plakken van de nucleïnezuren aan het glasoppervlak. Tijdens de scheiding zijn de glazen oppervlakken bekleed.

Open de stopkraan en schenk de vloeistof over in een conische buis. Bevestig vervolgens de kolom met twee klemmen aan een ringstatief om deze aan te sluiten op een circulerend waterbad. Sluit siliconen slangjes aan op het circulerende waterbad, zodanig dat de waterstroom vanuit het waterbad van onder naar boven loopt.

Stel de temperatuur in op 60 °C en start de circulatie. In de praktijk zouden de kolom en de slang worden omwikkeld met een isolatiemateriaal, zoals aluminiumfolie of schuimrubberen buisisolatie. Om warmteverlies te minimaliseren wordt deze stap hier niet getoond.

Om de procedure beter te visualiseren, sluit u de stopkraan. Voeg met een pipetteerder 10 milliliters steriel RNase-vrij water toe. Open de stopkraan en laat het water weglopen.

Was vervolgens opnieuw volgens de tweede wasstap. Spoel twee keer met 10 milliliters steriele RNA-vrije 0,12 molar fosfaatbuffer en giet dit tussen de wasbeurten af. De kolom is nu klaar voor hydroxyapatiet-chromatografie.

Zorg ervoor dat de stopkraan van de econ-kolom gesloten is. Voeg vervolgens met een steriele serologische pipette van twee milliliter langzaam twee milliliter van het voorbereide, resuspendeerde en gerehydrateerde hydroxyapatiet toe aan de bodem van de kolom. Plaats de kolomdop terug.

Laat het hydroxyapatiet 30 minuten lang bezinken onder invloed van de zwaartekracht. Deze methode vereist nauwkeurigheid. De hydroxyapatietkolom werkt met een snelheid van 0,25 tot 0,5 ml per minuut.

Het is daarom erg belangrijk om de kolom nauwlettend in de gaten te houden, zodat deze niet uitdroogt. Nadat er 30 minuten zijn verstreken, opent u de stopkraan om de buffer in een afvalbak te laten lopen. Sluit de stopkraan en gooi de doorstroomvloeistof weg.

Combine de nucleïnezuren met 0,12 molar fosfaatbuffer in een eindvolume van 500 µL en incubeer dit 10 minuten bij 60 °C. Hiermee worden de nucleïnezuren geëquilibreerd aan de temperatuur van de kolom en wordt de scheiding van de verschillende nucleïnezuren verbeterd door eventuele aanwezige secundaire structuren te verwijderen. Breng de nucleïnezuur-oplossing met een serologische pipette van twee milliliter snel aan op het hydroxyapatiet, waarbij u erop let dat de kolom niet wordt verstoord.

Zodra de volledige 500 µL op de kolom is gestroomd, kan een kleine hoeveelheid 0,12 M fosfaatbuffer bovenop de kolom worden toegevoegd om uitdroging te voorkomen. Laat de nucleïnezuren 30 minuten lang binden aan het hydroxyapatiet. Plaats na de bindingincubatie een conische buis van 15 mL onder de kolom.

Open vervolgens de stopkraan en verzamel de initiële monsterhoeveelheid van 500 µL, die enkelstrengs DNA bevat. Zodra er 500 µL is verzameld, sluit u de stopkraan. Voeg daarna zes milliliter 0,12 M fosfaatbuffer toe aan het hydroxyapatiet, waarbij u erop let dat de kolom niet wordt verstoord.

Open vervolgens de stopkraan en verzamel de doorstroom die enkelstrengs DNA bevat in dezelfde buis van 15 milliliter uit de vorige stap. Nadat er ongeveer zes milliliter is verzameld, sluit u de stopkraan. Voeg één volume van een fenol-chloroform-isoamylalcohol-oplossing toe aan de buis, meng krachtig door te vortexen en centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 3 500 ×g.

Na centrifugatie bevat de buis twee lagen. Draag de bovenste waterige laag, die het enkelstrengse DNA bevat, over naar een nieuwe buis van 15 milliliter en bewaar het monster bij kamertemperatuur. Om RNA uit de kolom te elueren en te zuiveren, voegt u zes milliliter 0,20 molair fosfaatbuffer toe en verzamelt u de flow-throughs in een nieuwe buis van 15 milliliter. Voer vervolgens een fenol-chloroformextractie uit.

Voer voor het enkelstrengs DNA-monster dit proces opnieuw uit met zes milliliters 0,40 molair fosfaatbuffer om dubbelstrengs DNA uit de kolom te elueren en te zuiveren. Herhaal dit proces ten slotte nogmaals om de kolom te ontdoen van elk residu dubbelstrengs DNA.

Gebruik ditmaal zes milliliter 1,00 molair fosfaatbuffer om de nucleïnezuurmonsters te ontzouten. Breng vier tot vijf milliliter van elk monster over naar een Ultra-4 centrifugale filtereenheid, uitgerust met een ultra-celmembraan met een afsnijwaarde van 30.000 molecuulgewicht. Concentreer het monster tot minder dan 500 µL door te centrifugeren bij 6.000 ×g bij 30 °C gedurende ongeveer vijf minuten in een rotor met een vaste hoek. Voeg, na het verwijderen van het filtraat, de rest van de monsters toe aan het filter.

Vul het volume aan tot vier tot vijf milliliter met RNAs free one XTE-buffer. Centrifugeer vervolgens opnieuw tot het gewenste geconcentreerde volume is bereikt. Ongeveer vijf minuten na het centrifugeren voegt u vier tot vijf milliliter RNAs free one XTE-buffer toe aan het filter en het concentraat.

Herhaal deze wasstap nog vijf keer om de nucleïnezuurmonsters volledig te ontzouten. Zodra de monsters volledig geconcentreerd en ontzout zijn, worden de resterende nucleïnezuurmonsters overgebracht naar een steriele microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Precipiteer de nucleïnezuren door toevoeging van één tiende van het volume natriumacetaat, twee volumes 100% ethanol en één microliter glyco blue; meng dit goed door middel van vortexen en centrifugeer.

28.000 g bij 4 °C gedurende 60 minuten centrifugeren. Zorg ervoor dat het pellet niet wordt verstoord.

Voeg 300 µL 70% ethanol toe en centrifugeer bij 28.000 ×g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten; laat dit vervolgens drogen en resuspendeer elke fractie in een passend volume RNAse-vrije TE-buffer. Gelijke concentraties van de virale nucleïnezuren M13 MP18 single-stranded DNA, MS2 single-stranded RNA, F6 double-stranded RNA en lambda double-stranded DNA werden gecombineerd en vervolgens gescheiden met hydroxyapatietchromatografie, zoals getoond in deze video. Gelijke concentraties van M13 MP18 single-stranded DNA, MS2 single-stranded RNA, F6 double-stranded RNA en lambda double-stranded DNA werden gecombineerd, zoals te zien is in baan zes, en aangebracht op een hydroxyapatietkolom, zoals hier te zien is.

Enkeldraads DNA/RNA en dubbelstrengs DNA werden onafhankelijk geëlueerd uit de hydroxyapatietkolom met behulp van 0,12 M, 0,18 M, 0,40 M en 1,00 M fosfaatbuffer. Een 1 KB ladder werd gebruikt om de genoomgroottes te bevestigen. Deze resultaten geven aan dat deze methode succesvol kan worden gebruikt om enkeldraads DNA, dubbelstrengs DNA en RNA te scheiden, met minder dan 9% carry-over van de ene fractie naar de volgende.

Deze methode werd ook gebruikt om nucleïnezuren te scheiden die waren geïsoleerd uit een virale gemeenschap in de Chesapeake Bay, zoals hier wordt getoond. Enkelstrengs DNA/RNA en dubbelstrengs DNA werden onafhankelijk geëlueerd met fosfaatbuffersconcentraties van respectievelijk 0,12 M, 0,20 M en 0,40 M, of 1,00 M; een high mass DNA-ladder in baan één en een 1 KB-ladder in baan twee werden gebruikt om het geschatte moleculaire gewicht en de massa van de nucleïnezuren visueel te bevestigen, zoals hier te zien is. Dubbelstrengs DNA was het dominante type nucleïnezuur dat werd geëxtraheerd uit het virale plankton van de Chesapeake Bay. Na het bekijken van deze video moet u een goed inzicht hebben in het scheiden van nucleïnezuren uit een gemengde virale populatie met behulp van hydroxyapatiet-chromatografie.

Dit omvat de preparatie van de hydroxyapatietkolom en de nucleïnezuren, de scheiding en elutie van nucleïnezuren met behulp van verschillende concentraties fosfaatbuffer en ontzilting, en het concentreren van de nucleïnezuren na scheiding.