Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van

Het algemene doel van deze procedure is het extraheren van DNA van malaria, parasieten en muggen uit de secties van de middendarm en kliersecties van de exemplaren. Dit wordt bereikt door de mug eerst precies door te snijden bij het gewricht tussen het abdomen en de thorax, waardoor de middendarm wordt gescheiden van de sectie met de speekselklieren. Vervolgens wordt elke sectie afzonderlijk vermalen in gedeïoniseerd water.

Vervolgens wordt de weefselisuspensie behandeld met loog en gewassen, waarna het celpellet wordt teruggewonnen. Ten slotte wordt het celpellet gereconstitueerd en gekookt, en wordt het DNA geëxtraheerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die DNA van hoge kwaliteit van zowel de mug als de malariaparasiet laten zien, dat geschikt is voor gebruik als template om anomalieën, vectorensoorten en het genotype van malariainfecties te identificeren via PCR en allelspecifieke restrictie-enzymdigestie.

Het belangrijkste voordeel van deze zeer eenvoudige techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals organische extractie en sorteermethoden, is dat er zeer weinig veilige en gemakkelijk verkrijgbare reagentia worden gebruikt en dat de verwerkingstijd aanzienlijk korter is. Om de muskiet te dissekeren, plaatst u deze op een klein stukje parafilm en monteert u deze onder een dissectiemicroscoop. Bedek de muskiet met een druppel gedeïoniseerd water.

Om het weefsel in fixatiemiddel te verzachten, wordt het muggenkarkas precies bij het gewricht tussen het thorax en het abdomen ingesneden. Hierdoor worden de kop en het thorax van het abdominale gedeelte gescheiden. Verplaats elk gedissecteerd muggendeel naar een schone, geautoclaveerde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, vooraf gelabeld met het identificatienummer van de mug en het lichaamsdeel. Verwijder de parafilm en veeg met een Kimwipe, bevochtigd met 70% alcohol, zorgvuldig de objecttafel van de microscoop schoon voordat u overgaat naar de volgende mug. Pipetteer voor het extraheren van het muggen-DNA eerst 20 µL gedeïoniseerd water in de monsterbuis.

Gebruik vervolgens de pipetpunt om de ondergedompelde muskietsectie te vermalen tot een uniforme suspensie. Voeg 100 µL van een geautoclaveerde XPBS 1% saponine-oplossing toe aan het monsterhomogenaat en meng dit voorzichtig door middel van vortexen. Incubeer het monster gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten bij 20.000 G en verwijder het supernatant. Resuspendeer het pellet in 100 µL 1X PBS. Herhaal daarna de centrifugatie.

Voeg 75 µL steriel gedeïoniseerd water en 25 µL van een 20% w/v Cellex 100-hars suspensie in gedeïoniseerd water toe en vortex voorzichtig om het pellet opnieuw te suspenderen met behulp van een steriele 23 gauge hypodermische naald die is gevlamd in een bunsenbrander. Prik een gat in het dopje van de monsterbuis.

Kook de monster-suspensie in een heating block gedurende 10 minuten. Centrifugeer bij 20.000 G gedurende één minuut en breng de DNA-oplossing over in een vooraf gelabeld bewaard buisje voor gebruik als template in PCR-reacties om de kwaliteit van het geëxtraheerde DNA te controleren en om een regio van het mitochondriale nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit four-gen van de arthropode te amplificeren, waarvan wordt verwacht dat dit een fragment van 400 baseparen oplevert. Om vervolgens onderscheid te maken tussen Ananais Gambia-soorten, wordt een regio geflankeerd door SNP's in de intergene spacer-regio geamplificeerd, waarvan wordt verwacht dat deze fragmenten van 390 baseparen oplevert voor Ananais Gambia Sens Stricto en 315 baseparen voor ananais api.

Ansis voert vervolgens de genotypering uit van de polymorfismen voor resistentie tegen antifolaatmedicatie bij P. falciparum. Voer een nested PCR uit om de regio rondom de aminozuurcodons 16, 51, 59, 108 en 164 te amplificeren. Voer in het dihydrofolaatreductase-gen van de parasieten een allelspecifieke digestie van het amplicon uit om resistentie tegen antifolaatmedicatie vast te stellen.

Geassocieerde polymorfismen. Controleer de reacties op een 2%AROS gel-elektroforese. Voorbeelden van resultaten uit PCR-assays voor de kwaliteitsanalyse van mosquito DNA-extract, RABIS moleculaire identificatie en p falciparum genotypering tonen aan dat de vereenvoudigde Kelex-methode soortgelijke resultaten oplevert als het standaard salting-out protocol, ondanks minder stappen en minder dan een kwart van de tijd, met een vergelijkbare DNA-kwaliteit in de respectievelijke extracten; het is dan ook niet verrassend dat de positiviteitspercentages van monsters met betrekking tot anomalieën, Gambia-zuster-soorten en parasitaire infectiepercentages statistisch niet verschilden op basis van de chi-kwadraat-toets van McNear.

De toevoeging van BSA aan reactiemengsels resulteert in een algemene toename van PCR-positieven door de verwijdering van PCR-remmers voor zowel het vereenvoudigde kelex- als het reguliere salting-outprotocol. Deze toename was echter niet statistisch significant, behalve voor de DNA-kwaliteit van kelex-extracten. Zodra de methode onder de knie is, maakt allelspecifieke restrictie-enzymvertering van het p. falciparum-amplicon het mogelijk om midgut- en speekselklierinfecties met malaria te genotyperen op drugresistente allelen.

Deze techniek kan, mits correct uitgevoerd, in ongeveer 37 minuten worden voltooid.