Cel-gebaseerde Calcium Assay voor medium tot hoge throughput screening van TRP Channel functies met behulp van FlexStation 3

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de toepassing van Flex Station three om het farmacologische profiel van het transient receptor potential- of TRPA1-kanaal te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst cellen voor te bereiden die TRPA1-kanalen tot expressie brengen in 96-wells microtiterplaten.

Nadat de cellen in een microplate-wasser zijn gewassen, worden de cellen geladen met de calciumgevoelige fluorescente kleurstof Flu-4. Na een beladingsperiode van de cellen volgen verschillende aanvullende wasbeurten. De volgende stap van de procedure is het voorbereiden van de compound-plaat, inclusief een triplo-agonist en een putatieve triplo-antagonist.

Als laatste stap worden de softwareparameters ingesteld voor het uitlezen van de plaat in het Flex Station three-systeem. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die dosis-responskurves tonen voor de activering van trip A one door flu phonemic acid, en inhibitie door de antagonist verbinding A. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in 21-activeringsmechanismen door calciuminstroom te meten, kan zij ook worden toegepast om functies van andere calciumpermeabele eye-kanalen en deep proteïne-gekoppelde receptoren te bestuderen met behulp van calciumgevoelige frozen-kleurstoffen of maly-potentiaalkleurstoffen.

Het belangrijkste voordeel van deze tactiek ten opzichte van bestaande methoden zoals calcium-imaging en handmatige patch-mapping is dat deze tijdbesparende techniek high-throughput screening mogelijk maakt voor de functie en modulatie van calciumformules, ijzerkanalen en andere ca-mobiliserende receptoren. Kweek vóór het begin van dit protocol HEC 2 93-cellen die stabiel zijn getransfecteerd met trip A one tot een dichtheid van 70 tot 90%, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Begin de celpreparatie voor de calciumassay door 96-wells platen te coaten door 50 µL poly-L-ornithine in elke well te pipetteren en de platen gedurende ten minste 15 minuten te incuberen bij 37 °C.

Spoel de cellen na incubatie één keer af met de fosfaatgebufferde zoutoplossing van KO. Na trypsinering van de HEC 2 93-cellen brengt u de gewenste hoeveelheid cellen over naar een steriele conische buis van 15 milliliter en centrifugeert u de monster. Verwijder het supernatant en resuspendeer de resulterende celpellet.

Breng in het DMEM-kweekmedium, aangevuld met 10% hitte-inactief foetaal runderserum, 100 µL van de celsuspensie aan in elke put van de 96-wells plaat. Laat de plaat met een multichannelpipet minimaal 30 minuten in de zuurkast staan voordat deze gedurende 20 tot 44 uur in de bevochtigde cellentkweekincubator wordt geplaatst. Bereid voor de voorbereiding van de calciumassay eerst de oplossingen zoals beschreven in het geschreven protocol.

Zodra voorbereid, meng 10 µL van 1 mM flu oh 4:00 AM met 10 µL van onic. F1 27, en breng de volledige inhoud over naar vijf milliliter flu. Oh four assaybuffer aangevuld met 0,1% bovine serumalbumine.

Was vervolgens de cellen die zijn gegroeid in 96-wellplaten met HBSS in een volume van 80 µL per well, twee keer met een microplate washer. Voeg na het wassen de Fluo-4 AM-laadoplossing toe in een volume van 50 µL per well met een multichannelpipet en incubeer de plaat gedurende één uur bij 37 °C. Bereid tijdens de laadperiode van één uur een reeks 3x-oplossingen van agonisten, een reeks 3x-oplossingen van antagonist en een groot volume 300 µM agonist in de Fluo-4-assaybuffer met een pipet.

Pipetteer 300 µL van de verdunde verbinding-oplossingen in een compoundplaat met 96 wells. Zorg ervoor dat de seriële verdunning van een verbinding en de bijbehorende positieve en negatieve controles indien mogelijk in dezelfde kolom van de compoundplaat worden geplaatst. Aangezien het Flex station drie één enkele kolom per keer uitleest, pipetteert u als laatste stap van de celvoorbereiding 300 µL van de 300 µM agonist-oplossing naast elke well die de antagonist bevat.

Was de geladen cellen drie keer met de flu oh four zuurbuffer met behulp van de microplaatwasser na de laatste wasbeurt. Laat 80 µL van de flu oh four zuurbuffer in elke put achter. Om te beginnen met het uitlezen van de plaat, schakelt u het Flex Station three systeem in en start u de soft max Pro 5.2 software.

Sla het experiment op onder een nieuwe bestandsnaam bij de setup. Kies de flex-modus en voer de parameters in om het agonist- en antagonisteneffect te meten, zoals vermeld in de schriftelijke procedure. Plaats vervolgens een nieuwe doos met tips, de compoundplaat en de leesplaat in de juiste trays van het flex-station. Drie.

Start het aflezen van de plaat door op de read-knop in de Soft Max Pro-software te klikken. De Flex Station three leest één kolom per keer af en voegt verbindingen toe op de voorgeprogrammeerde tijdstippen zonder het aflezen te onderbreken. Zodra de run is voltooid, kunnen de experimentele gegevens direct worden verwerkt met de Soft Max PRO-software of worden gekopieerd en geplakt in een willekeurig spreadsheetprogramma, zoals Microsoft Excel.

Om de gegevens te analyseren, worden concentratie-responscurves gegenereerd voor de TRPA1-agonist flupheniczuur en voor de vermeende TRPA1-antagonist verbinding A, met behulp van de kleinste-kwadratenmethode zoals beschreven in de schriftelijke procedure. TRPA1 is een calciumpermeabel kationkanaal waarvan activatie leidt tot een calciuminstroom die kan worden gedetecteerd met de calciumsensitieve kleurstof Fluo-4 AM. Representatieve traces van de tijdsvolgorde van fluorescentieveranderingen in reactie op een reeks flupheniczuur- of FFA-concentraties worden getoond bij hogere concentraties. FFA veroorzaakte fluorescentiestijgingen vertonen een veel snellere kinetiek dan bij lagere concentraties, ondanks vergelijkbare piekwaarden van de fluorescentie.

Om deze verschillen te onderscheiden, werd de concentratie-responscurve opgesteld door de initiële snelheden van de fluorescentiestijging te meten. Na toevoeging van variërende concentraties FFA werd de halfmaximale effectieve concentratie van FFA bepaald op 55,4 micromolar. De concentratie-responsrelatie van de inhibitie van de door FFA opgewekte calciumrespons door een vermeende TRPA1-antagonist, verbinding A, wordt eveneens getoond.

Een dosis verminderde onafhankelijk de respons van de A1-adenosinereceptoren op FFA met een halfmaximale inhiberende concentratie van 4,3 micromolair. Na het bekijken van deze video moet u een goed inzicht hebben in hoe u de farmacologische profielen van A1 en gerelateerde kanalen kunt bestuderen met behulp van de FluoStation 3.