Invriezen van embryo's door Mouse Ethyleen Glycol-Based Vitrificatie

Het algemene doel van deze procedure is om muizenembryo's te cryopreserveren in vloeibare stikstof en ze vervolgens te ontdooien voor de winning van levende muizen. Dit wordt bereikt door de muizenembryo's eerst onder te dompelen in een equilibratie-medium, ze over te brengen naar vitrificatiemedium in een cryobuis en ze daarna in een tank met vloeibare stikstof te plaatsen. Later kunnen de embryo's worden ontdooid in een medium met een hoge osmolariteit en worden geïncubeerd in kweekmedium totdat ze worden overgebracht naar ontvangende vrouwtjes.

Uiteindelijk tonen de resultaten een overleving van meer dan 90% van de embryo's na het ontdooien van de vitrificatie, en geboortecijfers tussen 30 en 70% na embryo-transfer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het permeabele cryoprotectum glycol minder toxisch is voor embryo's dan conventionele cryoprotectanten. Voorafgaand aan de start van dit protocol zal een technicus uit mijn laboratorium de procedure demonstreren.

Bereid twee-celstage muizenembryo's in cultuur, verkregen via natuurlijke paring of conventionele IVF-technieken, voor in een cryobuis voor uiteindelijke opslag door 50 µL embryo-vriesoplossing EF S 40 toe te voegen. Bereid vervolgens een plastic Petrischaal van 35 millimeter of 60 millimeter voor met 50 µL EFS 20 op kamertemperatuur.

Gebruik een glazen capillair om maximaal 30 embryo's naar de schaal over te brengen. Let erop dat er geen kweekmedium wordt overgebracht. Om uitdroging van de embryo's te voorkomen, plaatst u deze op de bodem van de druppel.

Zuig na ongeveer 60 tot 90 seconden de gedehydrateerde embryo's op met een capillairbuisje. Deze vertonen een gekrompen morfologie. Verplaats deze embryo's naar de EFS-oplossing in de cryobuis, waarbij zo min mogelijk EFS 20 wordt overgebracht.

Zodra de embryo's zijn overgebracht, laat u ze één minuut rusten in de EFS 40 voordat u ze invriest in vloeibare stikstof. Plaats vóór het ontdooien van de embryo's minstens twee druppels van 10 µL embryo-kweekmedium met een hoge osmolariteit, zoals M 16-medium, in een kweekschaal. Dek de druppels vervolgens volledig af met siliconenolie of minerale olie en plaats de schaal in een koolstofdioxide-incubator tot aan het gebruik.

Warm vervolgens de TS one-oplossing op tot 37 °C terwijl u een mondmasker en cryohandschoenen draagt. Haal de embryo's uit de vloeibare stikstoftank. Open nu snel de cryobuis en giet eventuele vloeibare stikstof terug in de tank of in een geschikte opvangbak.

Wacht vervolgens 30 seconden. Voeg nu 850 µL warme TS one-oplossing toe aan de cryobuis. Zuig de oplossing voorzichtig ongeveer 10 keer op en spuit deze weer uit, zodat deze gelijkmatig is opgelost.

Breng vervolgens het volledige volume over naar een plastic Petrischaal van 60 millimeter of naar een horlogeglas. Wacht drie minuten zodat de embryo's kunnen acclimatiseren aan de kamertemperatuur, waarbij ze voor de rest van de procedure moeten blijven. Gebruik geen verwarmingsapparaat.

Onderzoek de embryo's in de schaal snel onder een stereomicroscoop om hun aspect aan het begin van deze incubatie vast te stellen. Na ongeveer twee minuten incubatie worden de embryo's doen zinken door de schaal voorzichtig te schudden totdat het medium over het oppervlak van de schaal is verspreid. In de laatste minuut van de incubatie worden drie afzonderlijke druppels van 50 µL TS twee-oplossing in een schaal geplaatst.

Wanneer de drie minuten voorbij zijn, gebruik dan een stereomicroscoop om te bevestigen dat de embryo's licht zijn gekrompen. Als de embryo's nog steeds gezwollen zijn, zet de incubatie dan voort voor nog één tot drie minuten. Pak de embryo's nu op met een glazen capillair en breng ze over naar de eerste druppel TS twee.

Wacht drie minuten en breng de embryo's over naar de tweede druppel. Doe daarna hetzelfde voor de derde druppel. Haal ten slotte de voorbereide schaal met embryo-medium uit de incubator en gebruik een glazen capillair om de embryo's over te brengen naar de eerste druppel van het medium.

Indien onder een stereoscoop wordt onderzocht, zouden de embryo's langzaam hun normale morfologie moeten herstellen. Plaats de schaal nu gedurende ongeveer 10 minuten terug in de incubator. Was daarna de sucrose uit die is meegenomen uit TS twee.

Verplaats de embryo's naar de volgende druppel kweekmedium. Zet de embryo's verder in de CO2-incubator totdat ze worden overgebracht naar de uc van recipiënte vrouwtjes. Na vitrificatie en het herstellen van tussen de 300 en 480 embryo's van drie verschillende muizenstammen was de overleving zeer hoog.

Na het ontdooien lag het percentage embryo's met een normale morfologie tussen 93 en 99%, en van deze embryo's ontwikkelde ten minste 84% zich tot blastocysten. Houd er rekening mee dat werken met vloeibare stikstof uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om direct contact te vermijden en kortstondige blootstelling aan vloeibare stikstof te minimaliseren. Deze procedure dient altijd met de nodige voorzichtigheid te worden uitgevoerd.