Single Cell Fate Mapping in de zebravis

Het algemene doel van het volgende experiment is om fate mapping en lineage tracing uit te voeren van geselecteerde enkelvoudige cellen in zebravissenembryo's. Dit wordt bereikt door caged fluoresceïne chemisch te conjugeren aan dextran met een hoog molecuulgewicht. Vervolgens wordt het geprepareerde caged fluoresceïne-dextran in de zebravissenembryo's gemicro-injecteerd, waarna het in geselecteerde cellen wordt foto-geactiveerd met behulp van tweefotonabsorptie.

Na fotoactivatie van de embryo's wordt er immunohistochemische analyse uitgevoerd om het ontmaskerde fluoresceïne-dextrane te detecteren, teneinde de actieve cellen in kaart te brengen (fate mapping). Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om de afstammingsbijdrage en weefsel lokalisatie van de fotogeactiveerde individuele cellen te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard fluorescentiemicroscopie, is dat deze kan worden gebruikt om individuele cellen differentieel te labelen voor fate mapping.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals de wijze waarop ongedifferentieerde precursorcellen kunnen bijdragen aan verschillende weefseltypen. Een visuele demonstratie is essentieel, aangezien de stappen voor het monteren van het embryo en de fotoactivatie moeilijk te leren zijn op basis van enkel een tekstuele beschrijving. Synthetiseer voordat u begint caged fluoresceïne-dextran en bewaar dit in met metaalfolie omwikkelde buisjes. Micro-injecteer vervolgens embryo's in het stadium van één tot twee cellen met het gesynthetiseerde caged fluoresceïne-dextran.

Zodra de embryo's het juiste ontwikkelingsstadium hebben bereikt, moeten ze worden gecoat. Monteer vervolgens de gecoate embryo's in laag-smeltende agarose voor fotoactivatie. Wanneer de agarose is gestold, wordt de LSM 510-software geladen.

Plaats een transparant geel filter in de lichtbaan van het witte licht en selecteer vervolgens 'scan new image' en klik op 'start expert mode'. Selecteer het tabblad laser en schakel de argon-ion- en de Mi.Tai-laserbronnen in. Stel de Mi.Tai-golflengte in op 740 nanometer.

Select daarna het tabblad 'config'. Stel de configuraties van het optische pad in voor het argonne-ion en de mi tai-laser. Selecteer vervolgens het tabblad 'scan'.

Wijzig de objectiefinstelling naar 20x/0,8. Stel de maximale scansnelheid in door op 'max set mode' en 'method' te klikken en het getal op 'line mean' en 'one' respectievelijk te zetten onder het tabblad kanalen; deselecteer alle laserbronnen behalve de mi tai. Plaats vervolgens een vermogensmeter in het optische straalpad en selecteer daarna de con-knop om continu scannen te activeren.

Pas het transmissiepercentage aan totdat de powermeter een gemiddeld laservermogen van 47 milliwatts aangeeft. Stop vervolgens de scan door op de stopknop onder het tabblad kanalen te klikken. Deselecteer de mi tai laserbron en selecteer de argon-ijzerlaser.

Select vervolgens opnieuw de knop fast XY onder het tabblad kanalen en stel de pinhole, detect gain, amplify a offset en amplify opnieuw in voor de Argonne-ijzerlaser om de beste beeldkwaliteit te bereiken. Zoek met de tafelcontroller de cel die geactiveerd moet worden en stel deze scherp, klik vervolgens op de stopknop. Gebruik de bijsnijtool om de geactiveerde cel bij te snijden, zodat de uitsnedefactor onder het tabblad modus een waarde van 50 tot 70 weergeeft.

Stop vervolgens de scan door op de stopknop onder het tabblad kanalen te klikken. Deselecteer de argon-ionlaser en selecteer de My Tai-laser onder het tabblad modus. Stel de scansnelheid in op 31,46 seconden.

Select vervolgens de 'single'-knop om de scan te starten voor de tweefotonactivatie van het gecaged fluoresceïne-dextraan van de geselecteerde cel. Ga na activatie naar het tabblad 'channels', deselecteer de mi tai-laser en selecteer opnieuw de argon-ionlaser. Stel vervolgens onder 'mode' de zoomfactor in op één. Volgende.

Klik onder de kop 'speed' op de knop 'max' om de hoogste scansnelheid in te stellen. Om het foto-geactiveerde gebied te controleren, selecteert u 'fast xy'. Selecteer vervolgens het tabblad 'channels', pas de pinhole aan en voer de detectie opnieuw uit om te controleren of het foto-geactiveerde gebied niet door de laser is geablateerd.

Nadat de foto-geactiveerde embryo's zijn voorbereid voor uncaged fluoresceïne-dextrane immunodetectie volgens het protocol dat is beschreven in het bijbehorende manuscript, worden de embryo's zes keer gewassen in PBT en twee keer in AP-buffer. Plaats de embryo's vervolgens in negen-wells platen met AP-buffer.

Aspire vervolgens de AP-buffer en voeg N-B-T-B-C-I-P toe. Stop de ontwikkeling van de N-B-T-B-C-I-P-kleuring door de N-B-T-B-C-I-P-oplossing weg te zuigen. Was de embryo's daarna in PBT.

Herstel nu de embryo's en schud ze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op een roterend platform. Herhaal vervolgens het wassen met PBT nog twee keer. Monteer de embryo's tenslotte in 0,6% low melting agarose en leg beelden vast van de foto-geactiveerde cellen met behulp van een rechtopstaande compoundmicroscoop.

In deze figuur worden links een brightfield-opname en rechts een fluorescentie-opname getoond van een zebravisembryo waarin een caged fluoresceïne-dextran-streng is gemicro-injecteerd vóór fotoactivatie. Zoals hier te zien is, is het embryo gefotoactiveerd in een van de somieten, aangegeven door de pijl in de brightfield-figuur links, met een golflengte van 740 nanometers, een scantijd van 31 seconden en een gemiddeld laservermogen van 47 milliwatts. In de figuur rechts kan de fluorescentie van het uncaged fluoresceïne-dextran na fotoactivatie worden waargenomen.

Immuunkleuring van niet-gecageerd fluoresceïne-dextraan is afgebeeld in een klein gebied in de laterale plaat van het mesoderm van een embryo in het 10-somietstadium. De fotoactivatie is uitgevoerd met dezelfde laserparameters als in de vorige figuur, gevolgd door de immunodetectieprocedure. Het geactiveerde gebied, hier aangegeven door de pijl, kan na deze procedure worden geïdentificeerd met minimale achtergrondkleuring.

Aanvullende analyses, zoals immunokleuring voor verschillende weefselspecifieke markers, kunnen worden uitgevoerd om de locatie en het lot van gelabelde cellen beter te karakteriseren. Met deze techniek wordt de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de vasculaire biologie om de oorsprong van arteriële en veneuze progenitorcellen in ontwikkelende zebravisembryo's te bestuderen. Vergeet niet dat bij het werken met chemische reagentia zoals NBT en BCIP, deze extreem gevaarlijk kunnen zijn en er altijd handschoenen gedragen moeten worden.