Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

De in deze video getoonde methode maakt gebruik van lotkaarten van het embryo in het delingsstadium om individuele blastomeren geïsoleerd te kweken, om vast te stellen of het embryonale lot wordt bepaald door intrinsieke of extrinsieke instructies. Eerst worden twee-cel-embryo's verzameld waarbij de eerste delingsgroefHet lichtgepigmenteerde gebied van de animale hemisfeer doorsnijdt. Deze embryo's worden gekweekt; wanneer de embryo's 16 tot 32 cellen bereiken, wordt het vitellijnvlies verwijderd en worden naburige cellen weggesneden van de gekozen cel. Voor transplantatie wordt de gedissecteerde blastomeer vervolgens overgebracht naar een inkeping in een agaro-gecoate kweekput en gekweekt.

Zodra het explantaat het gewenste stadium heeft bereikt, wordt het geoogst om de gen- of eiwitexpressie te beoordelenen met behulp van in situ hybridisatie, qPCR of immunohistochemie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals het kweken van grote groepen embryonale cellen of organoïden, is dat individuele embryonale cellen waarvan het ontwikkelingslot bekend is uit lineage tracing-studies, gekweekt kunnen worden zonder toegevoegde groeifactoren of de aanwezigheid van naburige cellen. Men kan zo direct testen of factoren die intrinsiek zijn aan de cel die cel aanzetten om de precursor van een specifiek weefsel te worden, of dat daarvoor signalen van omliggende cellen vereist zijn.

Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de dissectie van Blairs en hun overdracht naar kweekputjes delicate handelingen onder de stereomicroscoop vereisen. In deze video zal ik deze methode gebruiken om aan te tonen of maternaal afgeleide mRNA's cellen sturen richting een neuraal lot. Werk onder een dissectiemicroscoop. Slijp vier sets pincetten met Illumina abrasief folie.

Eén pincet dient als reserve voor het geval een punt tijdens de procedure beschadigd raakt; autoclaaf alle vier de pincetten en bewaar deze in een steriele container. Maak telkens 500 milliliters van 0,1 x en 1,0 x gemodificeerde barth-zoutoplossing of MBS en steriliseer deze door filtratie. Bewaar deze oplossingen gedurende maanden bij 14 tot 18 graden Celsius in een glazen fles met schroefdop. Bereid 2% agarose van elektroforese-kwaliteit voor in 100 milliliters van 1 x kweekmedium. Autoclaaf om de agarose op te lossen en gebruik de magnetron om de agarose te vloeibaar maken wanneer deze vervolgens nodig is, terwijl de agarose vloeibaar is.

Giet ongeveer 0,5 milliliter op de bodem van elke put van een steriele 24-wells cultuurplaat. Dit voorkomt dat de implantaten aan het plastic kleven. Giet vervolgens ongeveer twee tot drie milliliter op de bodem van twee 360 millimeter Petri-schalen en draai ze voorzichtig rond om de vloeistof te verdelen.

Deze dienen als dissectieschaaltjes en de agar voorkomt dat embryo's aan het plastic blijven kleven. Zodra de membranen zijn verwijderd en de agar is afgekoeld en gestold, wordt de punt van een pipette van zes inch verhit met een vlam totdat deze tot een bolletje smelt. Verhit het bolletje kort opnieuw en raak hiermee voorzichtig het oppervlak van de agar aan in een putje van de kweekplaat.

Hiermee wordt een ondiepe inkeping gemaakt waarin het X explan wordt geplaatst. Herhaal dit voor elke put in de plaat. Vul vervolgens elke put van de kweekplaat met één milliliter van één x steriel kweekmedium.

Vul vervolgens de dissectieschaal met 0,1 XMBS om de scheiding van blastomeren te vergemakkelijken. Zodra de dissectieschalen zijn voorbereid, worden de bevruchte eitjes waarvan de gelei-omhulsels zijn verwijderd overgebracht naar Petri-schalen van 100 millimeter die 0,5 x kweekmedium bevatten. Eitjes die niet onmiddellijk worden gebruikt, kunnen worden gekweekt bij 14 °C terwijl de eerste schaal wordt gecontroleerd op embryo's in het tweecellige stadium.

Inspecteer de embryo's in de eerste petrischaal met een dissectiemicroscoop; gebruik een plastic transferpipet om ongeveer 10 1-cel- en 2-cel-embryo's over te brengen naar een aparte schaal gevuld met 0,5 x cultuurmedium. Plaats de petrischaal in een incubator van 14 °C. Het vermogen van deze assay om het ontwikkelingspotentieel van een cel nauwkeurig te beoordelen, is afhankelijk van het correct uitdissecteren van de blastome op basis van lotkaarten.

Daarom is het essentieel om in het tweecellige stadium embryo's te selecteren met het juiste pigmentatiepatroon dat vervolgens overeenkomt met regelmatige delingspatronen. Zoals hier wordt geïllustreerd, vinden regelmatige delingen vaak slechts aan één zijde van het embryo plaats.

Deze embryo's kunnen nog steeds als donoren worden gebruikt als de donorcel afkomstig is van de reguliere zijde. Wanneer de embryo's het tweecellige stadium bereiken, worden die embryo's waarbij de eerste klievingsgroef het lichtgepigmenteerde gebied in de animatorische hemisfeer doorsnijdt, in een aparte schaal gesorteerd; sorteer ongeveer vijf keer zoveel embryo's als er worden gedissecteerd. Deze zullen dienen als donoren voor het explantaat.

Houd de overige twee-cel-embryo's gedurende de procedure in een aparte schaal naast de donor-embryo's om als sibling-controles te dienen voor het bepalen van het stadium van het explantaat. Keer na het sorteren en disseceren van de embryo's terug naar de schalen in de incubator om meer één-cel- en twee-cel-embryo's te vinden. Aangezien het ongeveer 90 minuten duurt voordat één-cel-embryo's delen, kan dit tot twee uur na de eiverzameling worden gedaan.

Plaats vijf tot 10 embryo's in een dissectieschaaltje om de preparaten voor te bereiden. Positioneer vervolgens het eerste embryo zodanig dat het transparante vitellijnmembraan met een pincet kan worden gegrepen. Dit membraan is gewoonlijk niet zichtbaar, maar kan worden gegrepen bij de animale pool, waar het gescheiden wordt door een duidelijke parelruimte boven het oppervlak van het embryo.

Pak met een geslepen pincet in één hand de blastula op enige afstand van het te dissecteren object om beschadiging te voorkomen. Pak vervolgens met een geslepen pincet in de andere hand het membraan dicht bij de punt van het eerste pincet vast en trek voorzichtig in tegenovergestelde richtingen om het membraan af te pellen. Het embryo zal plat worden zodra het membraan is verwijderd.

Pak vervolgens met de pincet een naburige cel en gebruik deze cel als handvat, zodat de te dissekeren cel niet rechtstreeks met de pincet in de andere hand wordt aangeraakt; trek de overige naburige cellen voorzichtig weg van het gewenste blasteme. Indien midline-cellen met hetzelfde lot worden getarget, kunnen deze als paar samen worden verwijderd. Dissekeer tot slot de handvatcel weg.

Pak het blastomeer- of amere-paar op met een steriele glazen Pasteurpipet, waarbij luchtbellen en overmatige zuigkracht worden vermeden. Plaats de punt van de Pasteurpipet onder het oppervlak van het kweekmedium in een putje van de X-explanten kweekschaal en drijf het blastomeer voorzichtig uit. Het zou door zwaartekracht in de ondiepe inkeping moeten glijden.

Blastomeren van meer dan één embryo kunnen worden gecombineerd in één enkele explant door ze in dezelfde inkeping van een kweekplaat te plaatsen. Herhaal deze procedure één voor één met de resterende embryo's in de dissectieschaal. Na ongeveer 10 embryo's zal de dissectieschaal gevuld zijn met cellulair debris.

Wanneer dit gebeurt, stap dan over op het volgende dissectieschaltje. Controleer na voltooiing van alle dissecties of de explanen zich in de ondiepe inkepingen bevinden. Zo is dat niet, dan kunnen ze voorzichtig met een haarlus, die is gesteriliseerd in 70% Ethanol en aan de lucht is gedroogd, in de inkeping worden geduwd; incubeer de implantaten ongeveer een uur na de laatste dissectie bij kamertemperatuur op de werkbank.

Verwijder met een steriele glazen Pasteur-pipet het debris rondom het genezen explantaat. Plaats de plaat met het explantaat bij 14 tot 20 °C naast de Petrischaal met de controle-embryo's van dezelfde nestlichting. De sibling-embryo's dienen als indicator voor het ontwikkelingsstadium van het blasteem-explantaat.

Na ongeveer één tot twee uur in kweek zullen de geëxplante blastomeren ongeveer vier keer gedeeld hebben en het grootste deel van het residu van beschadigde naburige cellen hebben afgestoten. Na 20 uur vormen ze kleine, stevige cellenbolletjes. Wanneer de embryo's de gewenste ontwikkelingsfase hebben bereikt, kan het explantaat worden geoogst.

Deze explantaten overleven vrij goed, zelfs als sommige cellen desintegreren. Als er daarom een troebele massa in de kweek aanwezig is, onderzoeken we deze met een haarnaald of een pincet om vast te stellen of er een gezond explantaat in besloten ligt. Neem het explantaat op in een klein volume kweekoplossing met een glazen Pasteur-pipet en breng deze voorzichtig over in een fixeer- of lysisbuffer die geschikt is voor de uit te voeren analyse.

Twee dorsale blasphemers of twee ventrale blasphemers werden gedissekeerd in het 16-celstadium en gekweekt in één XMBS bij 14 graden Celsius totdat sibling-embryo's de vroege stadia van de neurale plaat bereikten. Elk monster werd geanalyseerd op de expressie van het zygotische neurale plaatgen Sox two via in situ hybridisatie, wat zichtbaar is als het blauwe reactieproduct.

De resultaten van deze assay tonen aan dat de meerderheid van de dorsale dierlijke blasphemers, welke precursoren zijn van de neurale plaat, SOX twee autonoom kunnen tot expressie brengen. Dat wil zeggen, zonder aanvullende signalering vanuit andere regio's van het embryo. Degenen die SOX twee niet tot expressie brengen, zijn mogelijk onjuist geïdentificeerd op het moment van dissectie.

Daarentegen brengen geen van de ventrale dierlijke blastomeren, die voorlopers zijn van de ventrale epidermis, SOX2 tot expressie. Deze gegevens geven aan dat dorsale dierlijke blastomeren een intrinsiek vermogen hebben om neuraal weefsel te vormen, terwijl ventrale dierlijke blastomeren dit niet hebben. Sommige van de dorsale blastomeren hebben bovendien een langgerekte morfologie ontwikkeld die wijst op de vorming van dorsaal mesoderm.

Deze blastomeren zijn tevens uitgewist om de neurale plaat in het intacte embryo te vormen en in een explantaatcultuur wordt een marker-eiwit voor de neurale plaat tot expressie gebracht om het effect van het wijzigen van de endogene niveaus van een maternaal tot expressie gebracht neuraal gen te testen. Fox D5 mRNA's werden geïnjecteerd in de ventrale precursor-blastomeren van het acht-cellige stadium. Zoals hier wordt getoond, vertoonde de meerderheid van de ventrale implantaten expressie van SOX2.

Omgekeerd, wanneer het endogene niveau van Fox D five werd verlaagd door injectie van antisense morpho-oligonucleotiden in de dorsale precursor-blastomeren in het acht-celstadium, drukte slechts een klein aantal dorsale blastomeren SOX two uit. Deze experimenten geven aan dat de maternale expressie van Fox D five een rol speelt in het intrinsieke vermogen van dorsale blastomeren om een neuraal lot aan te nemen. Voorafgaand aan deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het injecteren van mRNA's in de blastomeren voor gain-of-function of antisense morpho-oligonucleotiden voor loss-of-function.

Bijvoorbeeld: welke genen zijn betrokken bij het intrinsieke vermogen van cellen om een specifiek ontwikkelingslot te verkrijgen? Daarnaast kan men bekende signaleringsfactoren testen door gezuiverde factoren aan het kweekmedium toe te voegen. Deze aanpak kan ook worden gebruikt om individuele blastomeren naar nieuwe locaties in het intacte embryo te transplanteren.

Deze test bepaalt of de getransplanteerde cel gebonden is aan haar oorspronkelijke ontwikkelingsbestemming; deze informatie is cruciaal voor het definiëren van de cellulaire mechanismen waardoor een pluripotente embryonale cel gebonden raakt aan het worden van de precursor van een specifiek weefsel.