Cut-loading: Een handig hulpmiddel is voor de behandeling van de omvang van Gap Junction Tracer koppeling tussen het netvlies Neuronen

Het algemene doel van het volgende cut loading-experiment is om de mate van gap junction-tracerkoppeling tussen neuronen in het intacte netvlies te onderzoeken onder gecontroleerde verlichtingsomstandigheden. De eerste stap wordt bereikt door netvliezen door te snijden met een scherp mesje dat is gedoopt in een oplossing van neurobiotine, een tracermolecuul dat kan diffunderen door open gap junction-kanalen, maar niet door celmembranen. In de tweede stap worden de netvliezen geïncubeerd in Ringer-oplossing, wat diffusie van de tracer door open gap junction-kanalen mogelijk maakt.

Als de koppeling via gap junctions zwak is, zal de neurobiotine-fluorescentie beperkt blijven tot de retinale neuronen die zich dicht bij de doorsnede bevinden. Daarentegen zal de fluorescentie bij een sterke koppeling via gap junctions worden gedetecteerd in retinale neuronen die ver van de doorsnede liggen. Het belangrijkste voordeel van cut loading ten opzichte van bestaande technieken is dat het eenvoudiger uit te voeren is bij neuronen met kleine cellichamen in intact retinaal neuraal weefsel.

Het is bovendien eenvoudiger om de verlichtingsomstandigheden tijdens het laden van de coupes te controleren dan tijdens een elektrofysiologische studie van individuele neuronen in intact retinaal weefsel. Omdat de lichtstimuli die tijdens de elektrische registratie worden gebruikt zelf kunnen leiden tot veranderingen in de koppeling van gap junctions, zal de techniek worden gedemonstreerd door Dr. Chu Choi, een postdoc uit mijn laboratorium. Bij deze procedure wordt een goudvis gedurende ten minste één uur voor de operatie overdag in constant donker gehouden, en alle volgende stappen tot het moment dat het retinale weefsel wordt gefixeerd, worden overdag eveneens in constant donker uitgevoerd; annesteeseer de goudvis diep door 150 milligram per liter methaansulfonaat aan het aquariumwater toe te voegen.

Offer daarna de goudvis aan volgens de federale en universitaire richtlijnen en verwijder voorzichtig de oogbollen. Verwijder vervolgens het anterieure gedeelte van elke oogbol. Plaats daarna een stuk filterpapier op het posterieure gedeelte van het oog en keer het filterpapier en het oog om, zodat het filterpapier zich onder het posterieure gedeelte van het oog bevindt.

Verwijder nu voorzichtig de achterzijde van het oog, inclusief de sclera en het pigmentepitheel, van de donkergeadapteerde goudvis. Doorknip de oogzenuw van het netvlies met een fijne schaar. Het neurale netvlies van de goudvis, georiënteerd met de fotoreceptorzijde naar boven, moet nu vóór enucleatie aan het filterpapier worden bevestigd, terwijl de vis onder narcose is in 5 mL geoxygeneerde carbonate-gebaseerde Ringer-oplossing, met of zonder testmiddel, in elke put van een six-well plate, na dissectie van het intacte neurale netvlies uit het posterieure gedeelte van het oog.

Overbreng de retinae naar de wells onder constante duisternis. Seal vervolgens de wells met parafilm en laat het weefsel 30 minuten incuberen. Bereid 100 µL tracer-oplossing voor door 0,5% neurobiotine op te lossen in ringersolution vlak voordat er door de retina wordt gesneden.

Voeg vervolgens de neurobiotine-oplossing toe aan een glazen petrischaal. Tik daarna voorzichtig op het filterpapier waaraan het netvlies is bevestigd, terwijl u dit op een papieren handdoek houdt. Om overtollige Ringers-oplossing te verwijderen, doopt u een scheermesje in de neurobiotine-oplossing en maakt u een loodrechte radiale snede door het netvlies en het filterpapier.

Doop daarna het scheermesje opnieuw in de neurobiotine-oplossing en snijd het netvlies een tweede keer. Herhaal dit tot maximaal vier sneden per netvlies. Breng het netvlies bij deze stap 15 minuten over naar vers Ringers-medium, met of zonder testdrug, om belading en diffusie mogelijk te maken.

Was het drie keer met vers Ringer-medium, met of zonder testmedicijn, telkens gedurende vijf minuten. Fixeer vervolgens het retina met 4% paraformaldehyde in een 0,1 molaire fosfaatbufferoplossing bij kamertemperatuur gedurende één uur. Was het retina daarna overnacht bij vier graden Celsius met 0,1 molaire PBS door het in een koelkast te plaatsen tot de volgende dag.

Behandel het netvlies met 2% streptavidine Alexa 4 88 in 0,1 molar PBS en 0,3% Triton X 100 tot een eindconcentratie van 10 micrograms per milliliter en laat dit overnight incuberen bij vier graden Celsius. Was het netvlies de volgende dag drie keer met 0,1 molar PBS bij kamertemperatuur, telkens gedurende 10 minuten.

Los de retina los van het filterpapier in PBS. Monteer vervolgens de retina met een fijn penseel met de fotoreceptorkant naar boven op een objectglas met vector shield monteermedium. Plaats het objectglas in een laser-scanning confocale microscoop en maak foto's met dezelfde vergroting, resolutie en instellingen voor elke experimentele conditie, zodat de effecten van verschillende experimentele condities op de mate van functionele koppeling van de gap-tracer kunnen worden vergeleken.

Hier is de omvang van de koppeling van de fotoreceptorcel-tracer overdag in constante duisternis, vergeleken met overdag in constante duisternis in aanwezigheid van een selectieve dopamine D2-receptorantagonist. Let op dat de scheidsneden in beide afbeeldingen zich aan de linkerzijde bevinden. Hoewel een enkele afbeelding alle gelabelde cellen kan bevatten, wordt aanbevolen om een Z-stack van het gebied van belang te verzamelen en deze samen te voegen tot één enkele afbeelding zoals hier getoond.

Hier is de omvang van de koppeling van de photoreceptor-celtracer bij het sequentieel doorlopen van een dergelijke Zack. Let erop dat de scheiding met het scheermes in deze afbeelding zich aan de rechterkant bevindt. Om de omvang van de tracerkoppeling in de LSM-afbeeldingsbrowser te kwantificeren, opent u de afbeelding, klikt u vervolgens op exporteren en slaat u de afbeelding op als een TIF 16-bit niet-gecomprimeerd bestand; een schaalbalk moet in deze TIFF-afbeelding worden opgenomen met behulp van NIH ImageJ-software.

Meet de fluorescentie-intensiteit van Alexa 4 88-gelabeld neurobiotine op basis van beelden met lage vergroting van hole mount retina's. Open het TIFF-bestand met Image J-software en trek vervolgens een rechte lijn die overeenkomt met de schaalbalk. Ga daarna naar analyze, set scale, en voer de bekende afstand en lengte-eenheid in.

Klik vervolgens op oké. De fluorescentiemetingen kunnen nu worden weergegeven in gekalibreerde eenheden, zoals millimeters. Selecteer daarna het gebied van interesse met de rechthoekige selectietool.

De fluorescentiepiek moet zich aan de linkerrand van uw selectie bevinden. Zorg ervoor dat er geen fluorescentiesignaal nabij de rechterrand aanwezig is. Klik op analyze and plot profile voor de dagcontrolegegevens die zijn verkregen in constante duisternis.

Een curve met een exponentiële afname wordt van links naar rechts weergegeven. Klik vervolgens op kopiëren in het pop-upvenster en plak deze in Excel. Er zijn nu twee kolommen, één die de afstand tot de snede weergeeft en de andere de fluorescentie-intensiteit als functie van de afstand tot de snede.

Ter vergelijking worden de bovenstaande stappen herhaald met gegevens die overdag in constante duisternis zijn verkregen. Deel bij de aanwezigheid van spit bro elke ruwe fluorescentiewaarde door de maximale fluorescentiewaarde om de relatieve fluorescentie-intensiteit te verkrijgen. Kopieer de twee kolommen die overeenkomen met de afstand vanaf de snede en de relatieve fluorescentie-intensiteit, en plak deze vervolgens in de Origin-software.

Deze stappen worden getoond voor zowel de dagcontrole als het dagelijkse speeksel. Pas de data van dit punt aan de resultaten van de exponentiële vervalfunctie nummer één. Vergelijk de waarden van de tijdconstante bij verschillende experimentele condities met behulp van een T-test of ANOVA.

Exponentiële functies en statistische analyses van data van de daggroep controle, daggroep pip rone en de nachtgroep controle worden ter vergelijking getoond. Hier zijn voorbeelden van de mate van koppeling van de tracer in fotoreceptorcellen in het donkergeadapteerde netvlies van de goudvis gedurende de dag A, de nacht B, en gedurende de dag in aanwezigheid van one, een selectieve dopamine D twee receptorantagonist, zoals onthuld door de cut loading-techniek. Alle confocale beelden zijn voor vergelijking met dezelfde instellingen genomen.

In deze grafiek is de fluorescentie-intensiteit voor drie experimentele condities uitgezet als functie van de afstand tot de snede en gefit met de exponentiële functie. De cut loading-techniek wordt gebruikt om de mate van koppeling van tracers via gap junctions te kwantificeren door ruimteconstante-waarden te berekenen, zoals hier getoond voor drie experimentele condities. De cut loading-techniek kan ook worden gebruikt om elektrische synapsen tussen andere celtypen in het netvlies en in andere soorten te onderzoeken.

Bijvoorbeeld, deze twee figuren illustreren dat horizontale cellen van type A en type B bij het konijn homologe tracer-koppeling vertonen na cut loading en diffusie van neurobiotine onder donkergeadapteerde omstandigheden. We hebben de cut loading-techniek gebruikt om de mate van tracer-diffusie via de gap junctions tussen staafjes en kegeltjes overdag en 's nachts te bestuderen. Daarnaast kan deze techniek worden gebruikt om te bepalen of tracer-koppeling tussen andere retinale neuronen wordt aangestuurd door de retinale klok en/of door specifieke licht-donkercondities.

Het kan ook worden gebruikt om de tracerkoppeling tussen neuronen in andere hersengebieden te bestuderen.