PDMS Device Fabrication en modificatie van het oppervlak

Mijn naam is Ken Kotz. Ik ben postdoc hier bij het Bio MAs Resource Center, verbonden aan het Massachusetts General Hospital. Mijn belangrijkste onderzoeksproject houdt in dat ik neutrofielen isoleer met behulp van een immuno-affiniteitsopvangapparaat met microfluïdische structuren.

We gebruiken dit apparaat in vijf verschillende ziekenhuizen verspreid over het land om RNA te isoleren voor verdere genomische analyse. In feite bestaat het uit een master van SU8-fotolak op een ondergrond van silicium. We gaan een tweedelig elastomeer, PDMS, over deze master gieten, waarna het PDMS een mal zal vormen.

We halen de mastermatrijs uit de houder en plaatsen deze in een Petrischaal. De master wordt met tape op de bodem van de Petrischaal vastgezet. Op de weegschaal wegen we een mengsel van PDMS, harder en basisrubber af.

De verhouding is één deel harder op 10 delen hars. Meestal wegen we voor onze uitgesneden apparaten 20 tot 30 gram hars en respectievelijk twee tot drie gram harder af. Nadat zowel de harder als de hars in het kleine weegschaaltje zijn gegoten, gebruiken we een standaard plastic vork om de twee componenten te mengen.

Zorg ervoor dat u krachtig mengt en het mengsel over elkaar heen vouwt om te garanderen dat de harder gelijkmatig in de hars is verdeeld. Normaal gesproken controleren we hoe goed de twee componenten zijn gemengd. Aan de hand van het aantal luchtbellen proberen we een gelijkmatige verdeling van kleine luchtbellen door het elastomeer te verkrijgen.

Vervolgens gieten we de PDMS over de SU-8 master in de petrischaal. We plaatsen de master met de PDMS erop in een vacuümstolp en pompen de kamer leeg om de lucht die erin is gemengd te ontgassen. Normaal gesproken duurt het ontgassingsproces 30 minuten tot één uur.

Na het ontgassen halen we de apparaten uit de vacuümkamer en plaatsen we ze in een oven bij 65 tot 80 °C. De minimale uithardingstijd bij deze temperaturen is drie tot zes uur. In ons laboratorium laten we de apparaten gewoonlijk een nacht in de oven staan.

Gewoonlijk gebruiken we een chirurgisch stalen mesje nummer 11. We maken rechte sneden van ongeveer een halve centimeter vanaf de rand van de siliconen master en snijden rondom de rand van de master om een grote schijf te vormen. We pellen de PDMS-mal van de master en plaatsen deze met de structuurzijde naar boven in een schone Petrischaal.

We halen de losgekomen mal uit de Petrischaal en plaatsen deze op een snijoppervlak met behulp van een mes of een mes dat op een lineaire geleiding is gemonteerd. We snijden de apparaten die zich op de mal bevinden in secties. Elk gesneden apparaat wordt vervolgens teruggeplaatst in de Petrischaal voor verdere verwerking.

Om onze apparaten doorgaans te koppelen aan vloeistoffen, ponsen we gaten in het PDMS-apparaat. Het instrument dat we gebruiken om de gaten te ponsen, is een standaard spuit van 3 mm. Aan de punt van de 3 mm spuit bevindt zich een stompe roestvrijstalen naald.

Binnen in de roestvrijstalen naald bevindt zich een draad die precies in de binnendiameter van de naald past. Deze draad is bevestigd aan de zuiger van de spuit. Door aan de zuiger te trekken en de naald terug te trekken, kan er een gat in het PDMS worden geponst of een plug worden uitgestanst. Draai het PDMS-apparaat om en stoot het uit door op de zuiger te drukken.

Het geheim bij het gebruik van ponsinstrumenten is om de zuiger zo verticaal mogelijk te houden en het ponsinstrument helemaal niet te draaien. Wanneer u door de PDMS ponst, tilt u het gehele apparaat, het volledige PDMS-apparaat, met een pincet op, draait u het om en verwijdert u de plug door op de zuiger te drukken. U pakt de plug met een pincet vast en voert deze af.

Trek vervolgens de zuiger opnieuw in, klap het apparaat weer naar beneden en haal het snijinstrument eruit. Herhaal dit totdat alle gaten zijn geponst. Voor het hechtingsproces hechten we onze PDMS-devices aan glazen objectglazen.

Voor onze apparaten gaan we de PDMS irreversibel binden of covalent hechten aan glazen objectglazen. Dit wordt bereikt door ze in een plasma-asser te plaatsen en bloot te stellen aan een reactief zuurstofplasma. De stappen hiervoor zijn: neem het PDMS-apparaat en plaats het op de lade van de plasma-asser.

Met de kenmerken van het apparaat naar boven gericht, kunt u elk standaard glazen microscoopobjectglas gebruiken. Wij gebruiken een iets groter objectglas van anderhalve inch om in ons apparaat te passen. U kunt deze direct uit de verpakking gebruiken.

Wij geven er de voorkeur aan om deze te behandelen in een piranha-oplossing. Dit verwijdert alle organische verontreinigingen die zich op het oppervlak van het glazen objectglas kunnen bevinden. Nadat u het apparaat en het glazen objectglas op de lade van de plasma-asher heeft geplaatst, schuift u de lade in de plasma-asher en stelt u deze bloot aan het reactieve zuurstofplasma.

Nadat het programma van de plasma-asher is voltooid, openen we de kamer en verplaatsen we de plaat met onze devices naar het werkblad. Met een pincet tillen we het PDMS-device voorzichtig op, waarbij we erop letten de hechtvlakken niet met onze vingers aan te raken. We keren de hechtzijde naar het glas, op het glazen objectglas, en zorgen er vervolgens voor dat er geen luchtbellen tussen het PDMS en het objectglas zitten.

We plaatsen het PDMS-apparaat, dat nu aan het glas is gehecht, op een warmteplaat bij 65 tot 75 °C gedurende 10 minuten om een betere chemische binding te verkrijgen. In dit gedeelte gaan we de oppervlakken van het PDMS en het glas chemisch modificeren; na het hechten in de cleanroom blijven we over met een PDMS-oppervlak dat reactieve OH-groepen op het oppervlak heeft. Dit reactieve oppervlak is hydrofiel en zal uiteindelijk in de bulk van het PDMS diffunderen.

Om de oppervlaktechemie optimaal uit te voeren direct na de plasmabehandeling, gebruiken we een 5% oplossing van trimethoxysilaan (3-mercaptopropyltrimethoxysilaan). Het is een 5% volumeoplossing; we injecteren deze in de inlaat en zorgen ervoor dat het apparaat volledig is gevuld zonder luchtbellen.

Als er luchtbellen aanwezig zijn, drukt u deze met een pincet naar buiten. Nadat de slan is geïnjecteerd, laat u dit 15 tot 30 minuten rusten bij kamertemperatuur. Meestal injecteren we 10 minuten na aanvang van de reactie een tweede volume slan.

Nadat het silaan ongeveer een half uur heeft gereageerd, spoelen we alle apparaten door met drie tot vier apparaatvolumes pure ethanol. Het overschot dat we uitstoten, vegen we simpelweg weg met een chemische wipe. Na het spoelen van de apparaten pakken we ze op en plaatsen we ze op een warmteplaat die is ingesteld op 100 °C, zodat de aanwezige ethanol kan verdampen. Dit helpt om het silaanlaagoppervlak te fixeren.

Zodra het apparaat is gedroogd, kan het maandenlang in een desiccator worden bewaard, of u kunt het apparaat direct meenemen naar de volgende stap. Nadat de apparaten zijn uitgehard, beschikken ze nu over een silaancoating op zowel het glas- als het PDMS-oppervlak. De silaan is een capto-silaan met een thiolgroep, die zal reageren met onze heterobifunctionele crosslinker, GMBS.

Het is verdund in pure ethanol. Het is waterreactief, dus moet u er zorg voor dragen dat het niet wordt blootgesteld aan waterige omstandigheden. We injecteren het in de apparaten en we verwijderen eventuele luchtbellen met een pincet, zoals ik hier doe, om ervoor te zorgen dat alle oppervlakken zijn verzadigd met dit molecuul.

We dekken het af en laten het een half uur reageren. Nadat het GMBS een half uur heeft gereageerd, spoelen we de apparaten met gedeïoniseerd water om alle sporen van ethanol in het apparaat te verwijderen. Vervolgens laten we neutravidin, een biotinebindend eiwit, doorstromen.

De neutravain wordt vervolgens voorverdund tot een concentratie van 10 µg/mL. Indien er per ongeluk lucht in het apparaat wordt geïnjecteerd, moet het apparaat opnieuw worden gespoeld met ethanol om alle lucht effectief te verwijderen; ethanol bevochtigt de oppervlakken van het apparaat beter, waardoor eventuele luchtbellen die per ongeluk in het apparaat zijn gekomen, kunnen worden verwijderd. Zodra de apparaten zijn gespoeld met gedeïoniseerd water, vullen we het apparaat gewoonlijk met twee tot vier apparaatvolumes van de verdunde neutravain-oplossing.

De Nutt travain zal reageren met de GMBS, die aan het oppervlak is geïmmobiliseerd via willekeurige primaire middelen op de Nutt travain. Dit proces kan gedurende één uur bij kamertemperatuur plaatsvinden. Meestal plaats ik de apparaten overnacht in de koelruimte bij vier graden C.

Voordat we echter het antilichaam toevoegen, willen we alle ongebonden Aden in de oplossing uitspoelen. Dat doen we door een 1% BSA-oplossing, verdund in PBS, te laten doorstromen. Omdat deze chips zullen worden gebruikt voor downstream genomische analyse, zijn alle gebruikte oplossingen RNA-vrij.

Normaal gesproken spoelen we het apparaat met vier tot vijf volumes van de 1%BSA-oplossing. Vervolgens voegen we het antilichaam toe. Het antilichaam voor dit experiment is CD 66 B en antilichamen specifiek voor granulocyten in volbloed.

We gebruiken een concentratie van 10 tot 25 µg/ml en injecteren het antilichaam. We injecteren 200 µl antilichaam in elk apparaat. Dit doen we via twee injecties van 100 µl, waarvan één in elke poort van het apparaat.

Gewoonlijk injecteren we 100 µL in één poort, wachten we 30 minuten en injecteren we vervolgens nog eens 100 µL in de tegenoverliggende poort.