Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Het algemene doel van het volgende experiment is om neurale nakomelingen direct en exclusief af te leiden uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen door middel van inductie met kleine moleculen. Dit wordt bereikt door retinoïnezuur toe te voegen aan ongedifferentieerde cellen die onder gedefinieerde condities worden onderhouden. Vervolgens wordt het differentieproces voortgezet door de cellen los te maken in een suspensiecultuur, waar ze drijvende cellulaire clusters vormen die neuroblasten worden genoemd.

Wanneer neuroblasten zich mogen hechten aan een weefkweekplaat in neurale differentiatiemedium, ontwikkelen zij kenmerken van mature neuronen. Uiteindelijk kunnen immunofluorescentie en deconvolutie- of confocale microscopie worden gebruikt om het effect van behandeling met retinoïnezuur op de morfologie en marker-expressie van behandelde humane embryonale stamcellen aan te tonen. Bij andere technieken vertoont slechts een klein fractie van de cellen een neuronaal fenotype, terwijl onze methode een goed gecontroleerde, efficiënte inductie van pluripotente humane embryonale stamcellen uitsluitend richting een neuronale lijn mogelijk maakt door eenvoudige toevoeging van kleine moleculen.

Er zijn een paar stappen waar men voorzichtig mee moet zijn bij het bereiden van stockoplossingen. Zorg ervoor dat matrigel en humane laminine langzaam ontdooien van -80 °C naar 4 °C gedurende de nacht; bewaar media bij 4 °C en warm de media altijd op tot 37 °C voor gebruik. Daarnaast worden bij het bereiden van humaan ESL-medium sommige supplementen pas vlak voor gebruik toegevoegd.

Hiervan maken deel uit BFGF, ascorbinezuur, actieve menselijke insuline A en transferrine. Maak vervolgens de werkoplossingen van Matrigel of humaan laminine direct voorafgaand aan het coaten van de platen. Incubeer de platen bij 37 °C in 5% koolstofdioxide zodra de met gelatine voorgecoate weefselkweekplaten zijn voorbereid.

De gelatine kan worden vervangen door de Matrigel- of laminine-werkoplossing. Coat deze platen door ze een nacht lang te incuberen bij vier graden Celsius. Laat de menselijke ES-celkolonies eerst vijf tot zeven dagen groeien en bereid ze vervolgens voor op het splitsen.

Select kolonies waarvan meer dan 75% bestaat uit ongedifferentieerde humane ES-cellen; deze zijn meestal licht opaak met scherp gedefinieerde randen en bevatten opgestapelde cellen. Een indicatie voor het begin van differentiatie zijn witte kolonies, die meestal uit grotendeels gedifferentieerde cellen bestaan en er meestal helder uitzien. Selecteer geen witte of heldere kolonies.

Houd de platen tegen het licht en gebruik een marker om de licht ondoorzichtige kolonies op de bodem van de platen langs de randen om te trekken. Gebruik de rand van een steriele P2-pipetpunt om de omringende laag fibroblasten van de menselijke ES-celkolonie los te maken. Verwijder vervolgens de omringende fibroblastcellen en verwijder ook alle gedifferentieerde delen van de kolonie.

Sluis nu het oude medium dat de losgekoppelde gedifferentieerde cellen bevat af. Was vervolgens in elke put de ongedifferentieerde cellen één keer met menselijk E es-celmedium zonder BFGF, en voeg daarna drie milliliter vers menselijk ESL-medium toe dat BFGF bevat; BFGF wordt onmiddellijk voor gebruik aan het verse medium toegevoegd. Gebruik nu een steriele P2-pipetpunt om de kolonies in kleine stukjes te snijden en ze van de plaat los te maken.

Breng de losgekoppelde koloniestukjes samen met hun medium over naar een conisch buisje van 50 milliliter. Spoel elke put extra met 1 milliliter medium.

De cellen zijn nu klaar voor verdere differentiatie met behulp van kleine moleculen. Begin met het opwarmen van vers gecoate platen tot 37 °C. Aspireer de coatingoplossing uit de platen en voeg in elke well een aliquot van 4 ml medium met colony-fragmenten toe; plaats de platen vervolgens voorzichtig in een incubator zonder ze te schudden.

Verstoor de platen niet, zodat de cellen kunnen hechten. Maak na drie dagen hechtingsperiode nieuw medium dat omic-zuur bevat. Verwijder vervolgens het grootste deel van het oude medium, waarbij slechts genoeg medium wordt overgelaten zodat de cellen ondergedompeld blijven.

De cellen mogen nooit uitdrogen in elke put. Voeg vier milliliters vers medium voor menselijke ES-cellen toe met BFGF en retinoïnezuur. Vervang het medium om de dag en laat de met retinoïnezuur behandelde menselijke ES-celkolonies groeien.

Na zeven of acht dagen zullen de cellen morfologische veranderingen hebben ondergaan tot grote gedifferentieerde cellen. Ga vervolgens over tot het maken van een suspensiecelcultuur; begin het maken van een suspensiecultuur door ESL-kolonies los te koppelen van cellen die spontaan zijn gedifferentieerd en zijn gemigreerd om een fibroblastlaag te vormen. Gebruik hiervoor de eerder genoemde techniek met een steriele pipetpunt en aspireer vervolgens het oude medium weg dat zwevende, losgekoppelde fibroblastcellen bevat.

Was de cellen één keer met HESC-medium en resuspendeer ze in drie milliliter HESC-medium. Gebruik nu een steriele P2-pipetpunt om de koloniën in kleine stukjes te snijden en ze van de plaat los te maken.

Halen het medium met de losgekoppelde kolonies over in één conische buis van 50 milliliter. Spoel de putjes met één milliliter medium en voeg het spoelmiddel toe aan de pool. Verdeel vervolgens aliquoten van vier milliliter van de gepoelde cellen over elke put van een six well ultra-low attachment plaat gedurende vier tot vijf dagen en bewaar de plaat in een incubator.

Gedurende deze tijd zullen drijvende cellulaire clusters of neuroblasten zich vormen om de neuroblast verder te laten ontwikkelen naar een rijper neuronaal fenotype. Trek het medium dat deze bevat in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten bij 1 400 RPM.

Zuig het oude medium af, weeg zoveel mogelijk van dit medium en voeg een gelijke hoeveelheid vers NSC-medium toe dat VEGF NT3 en BDNF bevat. Meng de cellen tot een suspensie door te pipetteren, verdeel vervolgens vier milliliter van de suspensie per putje over zes putjes in weefselkweekplaten en plaats de platen in een bevochtigde incubator bij 37 °C.

De neuroblasten hechten gedurende de nacht aan de kweekplaten voor een 3D-kweek door Matrigel of menselijke laminaat aan de neuroblast-suspensie toe te voegen. De 3D-matrix polymeriseert bij 37 °C. Vervang het medium om de dag.

Binnen twee weken zullen uitgebreide netwerken van neuriet-dragende neuronale cellen en gepigmenteerde cellen verschijnen; retinoïnezuur blijkt voldoende om menselijke ES-cellen die in het gedefinieerde culturesysteem worden onderhouden, te induceren om over te gaan van pluripotentie exclusief naar een neuro-epidermaal fenotype. Na blootstelling van ongedifferentieerde menselijke ES-cellen aan retinoïnezuur ondergingen alle cellen binnen de kolonie morfologische veranderingen naar grote gedifferentieerde cellen die stopten met het tot expressie brengen van de pluripotentie-geassocieerde marker OCT four. De cellen begonnen daarnaast diverse neuroectoderm-geassocieerde markers tot expressie te brengen, zoals HNK one a, P two en TRKC.

Deze grote gedifferentieerde cellen bleven zich vermenigvuldigen en de koloniën groeiden in omvang, waarbij ze spontaan de vroege neuronale marker bèta drie tubuline tot expressie brachten. De meer mature neuronale marker map twee begon te verschijnen in delen van de koloniën waar cellen zich hadden opgehoopt. Gelijktijdig met het verschijnen van de neuroectodermale cellen transloceerde de neuronenspecifieke transcriptiefactor NER one, die betrokken is bij dopaminerge neuronale differentiatie en activatie van het tyrosinehydroxylase-gen, naar de nucleus.

Na loskoppeling vormden de met retinoïnezuur behandelde menselijke ES-cellen neuroblasten in een suspensiecultuur na verwijdering van basis FGF; nadat de neuroblasten waren toegestaan zich aan een weefselkweekplaat te hechten, begonnen uitgebreide netwerken van neurite-dragende neuronale cellen en gepigmenteerde cellen, typerend voor het CZS, te verschijnen met een drastische toename in efficiëntie, welke gedurende drie maanden gecultiveerd konden worden. Deze uit menselijke ES-cellen afgeleide neuronale cellen vertoonden expressie van bèta-drie tubuline in vergelijking met de spontane multilijnage differentiatie van cellen zonder behandeling met retinoïnezuur en co-exprimeerden map twee. Eenmaal beheerst kan deze techniek, mits correct uitgevoerd, in ongeveer vier weken worden gebruikt om uniform neuronale progenitoren en neuronale cellen te genereren uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen.

Vergeet niet dat het werken met menselijke cellen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen voordat deze procedure wordt uitgevoerd, zoals het controleren of de cellijnen vrij zijn van pathogenen en mycoplasma.