Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is om een zeer efficiënte differentiatie van dopaminerge neuronen te induceren. In vitro. Dit wordt bereikt door eerst een cultuur van eencellige adhesie van humane P pluripotente stamcellen voor te bereiden.

In de tweede stap wordt het celcultuurmedium omgeschakeld naar neuroninductiemedium om floorplate-progenitorcellen te induceren. Vervolgens worden de dopaminerge neuronen gekweekt in rijpingsmedium. En uiteindelijk worden de encellige dopaminerge neuronprogenitorcellen gedurende 30 dagen gekweekt op poly L ornithine laminate fibronectine platen en rijpingsmedium.

Uiteindelijk kan immunofluorescentiemicroscopie worden gebruikt om de expressie van belangrijke dopaminerge neuronmarkers te beoordelen. Deze techniek heeft een groter voordeel boven het bestaande neurosfeer op neuro-zuurprotocol. Het kan een meer homogene dubbele neurale populatie genereren met een hogere efficiëntie.

Vier dagen na passage aspireer het medium van de celculturen. Los de cellen met één milliliter Accutane per putje en incubeer ze gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Tijdens de incubatie voeg je één milliliter gelatine toe aan elke put van een zesputsplaat en plaats je de plaat samen met vers bereide matrigel-gecoate platen in de incubator.

Wanneer de cellen semi-zwevend zijn geworden, pipet ze meerdere keren op en neer om een encellige suspensie te maken. Trek vervolgens de cellen in een buis van 15 milliliter en centrifugeer ze gedurende drie minuten. Bij 258 Gs en kamertemperatuur, suspendeer de pellet opnieuw in de juiste hoeveelheid humaan pluripotent stamcelcultuurmedium gesupplementeerd met serum en voeg thi vivin toe tot een uiteindelijke concentratie van twee millimolair.

Vervolgens incubeer je de cellen in de met gelatine gecoate platen in een verhouding van één op één bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Om de meth feeders te verwijderen, breng je de cellen over naar een nieuwe buis van 15 milliliter. Verdun ze in humaan pluripotent stamcelmedium, gesupplementeerd met serum, en tel ze na het opnieuw centrifugeren van de cellen, suspendeer de cellen in MT.SR een medium met thias Ivan tot een concentratie van 180.000 cellen per milliliter.

Aspibeer vervolgens het matrigel van de gecoate platen en verdeel twee milliliter cellen per put. 48 uur. Na het overplaatsen van de cellen naar de matrigel platen.

Aspibeer het medium van elke put en was de cellen eenmaal met PBS. Voeg vervolgens twee milliliter KSR differentiatiemedium, gesupplementeerd met SB 4 31, 50 42 en L DN 1 9 3 1 8 9 toe aan de cellen. Ververs het medium elke dag van D nul tot D 20, zoals aangegeven in de grafiek. Op dag 20 aspireer je het differentiatiemedium en los je de cellen op met één milliliter 37 graden Celsius acutus per putje gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Tijdens de incubatie verwarm je poly L orine laminine fibronectine platen in de incubator.

Na Resus, suspendeer je de losgehechte cellen in een encellige suspensie, verdun je de cellen in neuro basale media. Na het tellen, centrifugeer je de cellen en suspendeer je het pellet opnieuw in B 27, differentiatiemedium met een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter. Aspibeer vervolgens de fibronectine van de polyol orine laminine fibronectine platen.

Was ze twee keer met PBS en breng 400 microliter cellen over naar elk putje. Verander uiteindelijk het medium na de eerste 24 uur en vervolgens om de andere dag tot aan het experimentele eindpunt om eventuele niet-gehechte dode cellen te verwijderen. Zoals geïllustreerd in deze afbeeldingen, zullen gerepliceerde encellige humane pluripotente stamcelculturen zich uitbreiden als clusters gedurende de eerste 48 uur van differentiatie, waarbij ongeveer 70% confluëntie wordt bereikt.

Na differentiatie bereiken de cellen volledige confluëntie in slechts drie tot vier dagen. Tegen dag 20 hechten en groeien de gedifferentieerde cellen als kleine klontjes. Gedurende de volgende vijf dagen verschijnen er veel meer intensieve en morfologisch intacte axonen en neuriten binnen de klontjes, waarbij enkele verbindingen tussen de klontjes worden gevormd.

Na 11 dagen differentiatie kunnen de humane pluripotente stamcellen efficiënt worden omgezet in floor plate-precursoren. Zoals gedemonstreerd in deze afbeeldingen, drukken bijna alle cellen de floor plate-precursor, celmarkers nest in en fox A twee en over uit. 90% van de cellen drukken Corin O OTX twee en LM X een A uit. Na verdere differentiatie specialiseren de floor plate-precursorcellen zich in dopaminerge neuronen die TUJ een en TH uitdrukken. Deze dopaminerge neuronen hebben een identiteit van negen omdat ze GK twee uitdrukken en negatief zijn voor calbindin. Immunokleuringsexperimenten tonen ook aan dat er geen GFAP-astrocyten zijn en zeer weinig GABAerge neuronen, wat aangeeft dat de differentiatie uitsluitend specifiek is voor de dopaminerge neuronlijn.

Bij het testen van deze procedure is het belangrijk om consistentie te behouden in de dagelijkse celcultuur en ervoor te zorgen dat het medium vers wordt bereid met de juiste ingrediënten.