Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdig het transmembraanpotentiaal en de intracellulaire calciumtransiënt optisch in kaart te brengen in intacte, geïsoleerde en met LOR geperfuseerde muizenharten. Dit wordt bereikt door eerst het intacte muizenhart te excideren, vervolgens de aorta te canuleren en te beginnen met de LOR-perfusie. De volgende stap is om het hart te immobiliseren door een excitation contraction coupler te laden en vervolgens het hart vast te pinnen in de perfusiekamer.

De laatste stappen zijn het laden van de optische kleurstoffen en het treffen van voorbereidingen om bewegingsartefacten tijdens het experiment te verminderen. Optische beelden worden verkregen door het licht dat door het hart wordt uitgezonden op te vangen met my cam Ultima LC Moss-camera's. Hey, mijn naam is di.

Ik ben een promovendus aan de Washington University. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals micro-elektroden, is dat optical mapping een hogere ruimtelijke resolutie mogelijk maakt over het gehele hartoppervlak. Hallo, ik ben Matt Sulkin.

Ik ben een promovendus aan de Washington University. Deze methode kan, mits correct uitgevoerd, helpen bij het beantwoorden van veel vragen in de cardiale elektrofysiologie, zoals de basis van aritmogenese. Begin met het configureren van één peristaltische pomp om de oplossingen te laten circuleren met een snelheid van 40 milliliters per minuut.

Stel vervolgens een tweede peristaltische pomp in op 80 milliliters per minuut. Deze pomp voert het Perfuse eight terug naar het bewaar- en zuurstofreservoir. Zet de pompen aan en spoel het systeem 30 minuten lang met recirculatie met één liter 70% ethanol.

Volg deze spoeling met twee liter gedeïoniseerd water zonder recirculatie. Zodra het water is afgevoerd, circuleert u twee liter Tyro-oplossing en laat u dit door een vijf micron filter lopen. Warm het perfuse op tot 37 °C met een watermantel en circulator, en borrel geoxygeneerd gas in de oplossing.

Pas de snelheid van het gasborrelen aan om de pH op 7,35 plus of min 0,05 te houden. Monitor zowel de pH als de temperatuur tijdens het experiment. De dubbele optische mapping-apparatuur bestaat uit twee CMOS-camera's met hoge snelheid die een afbeelding van 100 bij 100 pixels kunnen vastleggen bij 3000 frames per seconde.

Bevestig een banddoorlaatfilter aan de calciumbeeldgevingscamera en een langdoorlaatfilter aan de voltagescanscamera op een dubbele camerahouder. Bevestig een dichroïsche spiegel en lens zodanig dat het emissielicht afkomstig van het hart door de lens op de spiegel wordt gefocust. Bevestig daarnaast twee camera's aan de houder en plaats deze zodanig dat ze loodrecht op elkaar staan.

Stel vervolgens de excitatieverlichting in. Het licht wordt gegenereerd door een halogeenlamp en via een flexibele lichtgeleider geleid. Leid het licht door een warmtefilter, een sluiter om de blootstelling te beperken en een excitatie-banddoorlaatfilter.

Bereid tot slot de zilver- en zilverchloride-elektroden voor door deze in de kamer te plaatsen. Na het dubbel controleren en afstellen van de niveaus op de versterkers en filters is de opstelling klaar voor een hart. Gebruik een cocktail van ketamine en xylazine met 100 units heparine om een muis te anesthetiseren voordat u verdergaat.

Bevestig dat het dier geen pijnreflex heeft door middel van een knijpreflex in de teen. Maak na een mediaal sternale incisie het hart en het omliggende weefsel snel vrij. Identificeer vervolgens met een dissectiemicroscoop snel de aorta en maak een schone doorsnede door de aorta ascendens onder de rechter arteria subclavia.

Bevestig nu een kort stuk aorta aan een op maat gemaakte 21 gauge canule met vier 4-0 zwart gevlochten zijden hechtingen. Na canulatie wordt het hart retrograde geperfuseerd en gesuperefuseerd met Tyrode-oplossing; pas de stroomsnelheid aan om de aortadruk tussen 60 en 80 mmHg te houden, gemeten met een druktransducer.

Dissekeer nu en verwijder het omliggende long-, thymus- en vetweefsel. Plaats vervolgens een siliconen slang via de longaders in de linker ventrikel. Hecht de slang vast aan het nabijgelegen bindweefsel.

Deze zeer belangrijke stap voorkomt congestie en verzuring van Perfuse eight dat vastzit in de linker ventrikel, vooral na het onderdrukken van ventriculaire contracties. Om door Perfuse eight geïnduceerde hartbewegingen te voorkomen, wordt het hart bij de apex vastgepind aan de bodem van de met sill guard gecoate perfusiekamer. Rek daarnaast de rechter- en linkerauriculaire appendages uit en pin deze vast om het oppervlak van de atria in de rechtopstaande configuratie te vergroten.

Dit zal het registratieoppervlak maximaliseren. Om de pacing-stimulaties uit te voeren, bevestigt u een op maat gemaakte elektrode op het hartoppervlak. Om bewegingsartefacten te verminderen, bevestigt u een klein dekglas over het hart op het oppervlak van de oplossing.

Doe dit door het glas tussen meerdere pinnen te klemmen. Focus als laatste voorbereiding het excitatielicht op het hart en positioneer de camera's om een optisch beeld te verkrijgen, begin vervolgens met het laden van de kleurstof terwijl de kleurstoffen worden geladen. Bewaak continu de ECG-registraties om een normale elektrische functie van het hart te waarborgen.

Begin met het opwarmen van BLEs statine tot kamertemperatuur. Meng vervolgens een halve milliliter BLEs statine in de profuse eight in het opvangreservoir, en verdun de resterende 0,1 milliliter BLEs statine in één milliliter Tyros-oplossing. Injecteer gedurende de volgende 20 minuten langzaam de BLEs statine in tyros via een drug port nabij de canule.

De BLEs-statine zal het bewegingsartefact geleidelijk verminderen. Verdun vervolgens 30 µL spanningsgevoelige kleurstof in één milliliter tyro-oplossing en injecteer dit mengsel langzaam gedurende vijf tot zeven minuten in dezelfde drugport. Maak daarna hetzelfde mengsel opnieuw.

Voeg nu nog eens 30 µL calciumindicator toe. Breng dit mengsel langzaam gedurende vijf tot 10 minuten via dezelfde poort aan. Nadat de calciumindicator is geïnjecteerd, wacht u nog vijf tot 10 minuten zodat de BLEs-statine de beweging volledig kan onderdrukken en de kleurstoffen de cellen kunnen binnendringen voordat u verdergaat met het experiment.

Deze hartpreparaat is gemaakt. Volgens het protocol werden ECG-signalen geregistreerd tijdens ventriculaire pacing vanaf S1-S1 stimulatie. Actiepotentialen en calciumtransiënten werden geregistreerd vanuit de atria aan de linkerzijde en de ventrikels aan de rechterzijde.

De pijl geeft aan waar signaalverstrooiing vanuit de ventrikels plaatsvond; door de opnames van de camera te groeperen in eenheden van drie bij drie pixels, kan een matrix van calciumtransiënten en actiepotentialen worden weergegeven op basis van de gegevens uit de array-data. Er kan een figuur worden opgesteld die de geleiding van het actiepotentiaal laat zien. Gegevens van drie opeenvolgende punten op de transversale en longitudinale as tonen de amplitudeverandering bij de voortplanting van het actiepotentiaal over een ventriculair oppervlak.

Hetzelfde geldt voor een figuur die de duur van de actiepotentiaal en de calciumtransiënt weergeeft. Hierbij wordt links een controleconditie getoond en rechts een behandelconditie. Er is isoproterenol in het hart geïnjecteerd, wat de duur van zowel de calciumtransiënten als de actiepotentialen duidelijk verkort.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee tot drie uur worden voltooid volgens deze procedure. Andere methoden, zoals een pacing-protocol, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals die over de refractaire periode van de AV-knoop.