A Simple Protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde Klontvormende van

Deze procedure biedt enkele gestandaardiseerde richtlijnen voor het uitvoeren van assays voor bloedplaatjes-gemedieerde klontering van klinische of laboratoriumisolaten van Plasmodium falciparum. Verzamel eerst bloed van een geïnfecteerde patiënt en oogst de geparasiteerde erytrocyten door centrifugatie, en kweek en zuiver vervolgens de mature aseksuele stadia. Verzamel daarna bloed van een gezonde donor om bloedplaatjesrijk plasma voor te bereiden en te standaardiseren door centrifugatie.

Combineer zowel de bloedplaatjes als de geparasiteerde erytrocyten voor de klonteringsassay. De resultaten van immunofluorescentiemicroscopie kunnen P. falciparum-klonten aantonen die worden gemedieerd door bloedplaatjes. Deze techniek is specifiek ontworpen om het klonteringsfenotype van Plasmodium spp. te meten.

Klinische isolaten in een omgeving met beperkte middelen. Er is gemeld dat minimale variaties in procedures de uitkomst van de clumping acid-test in het veld beïnvloeden. Daarom was er behoefte aan een helder en gemakkelijk te volgen protocol, aangepast aan omgevingen met beperkte middelen, om standaardisatie over malaria-endemische veldlocaties te realiseren. Verzamel in een sodiumcitraat-vacutainer ongeveer vijf milliliter volbloed van een gastheer zonder malaria-ervaring of 2,5 milliliter bloed van patiënten met CM- of SM-malaria.

Centrifugeer het volbloed bij 250 Gs gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Draag vervolgens het troebele supernatant voorzichtig over naar een schone buis van 15 milliliter. Houd er rekening mee dat bloedplaatjes gemakkelijk worden geactiveerd door temperatuurschommelingen en fysieke schokken.

Tel de PRP-suspensie met een Neubauer-hemocytometer en pas de gewenste concentratie aan met PBS. Verkrijg een platelet poor plasma-pellet, waarbij het merendeel van de bloedplaatjes uit een deel van de PRP-fractie wordt verwijderd door centrifugatie bij 1500 ×g gedurende 10 minuten. Bewaar de PRP- en PPP-fracties bij 4 °C voor maximaal 8 tot 10 dagen. Gebruik idealiter verse bloedplaatjes voor de clumping-assay.

Was de gepelletteerde perifere rode bloedcellen drie keer met vijf tot 10 milliliters RPMI 1640 in een kweekfles. Vul de PRBC aan met standaard malariakweekmedium en verse niet-geïnfecteerde rode bloedcellen om een hematocriet van 5% te bereiken. Spoel de kweekflessen door met een mengsel van 92.5% stikstof, 2.5% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Sluit deze vervolgens af en kweek ze voor rijpe parasieten uit patiënten-pbcs.

Incubeer de kweekfles gedurende 24 tot 36 uur in een incubator bij 37 °C met 5% carbon dioxide. Plaats ongeveer 10 tot 15 µL bloed op één uiteinde van een matglasplaatje dat op een vlak oppervlak rust. Raak de bloeddruppel aan met de rand van een tweede objectglas, terwijl het tweede objectglas in een hoek van 45 graden wordt gehouden, totdat het bloed gelijkmatig over de rand van het tweede objectglas is verspreid.

Verspreid het bloed snel maar voorzichtig gelijkmatig over de eerste objectglasplaat, zonder te veel druk uit te oefenen. Laat de dunne bloedfilm vervolgens aan de lucht drogen en dehydrateer het monstergebied gedurende 10 seconden met methanol. Laat dit daarna opnieuw aan de lucht drogen en dompel het monster vervolgens onder in 2% keem.

Laat dit ten minste 10 minuten inwerken. Spoel uitgebreid tot het water helder is en laat aan de lucht drogen. Onderzoek de monsters onder een 100 x olie-emulselens op een lichtmicroscoop.

Purificeer en synchroniseer vervolgens de mature PFS parum, PRBC zoals beschreven in het tekstprotocol. Draag de cultuur over naar een schone, steriele buis van 15 milliliter. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij kamertemperatuur bij 370 GS gedurende vijf minuten.

Aspire nu voorzichtig het supernatant zonder het pellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens de cellen zodanig dat de helft van het totale volume bestaat uit jello fusing. Van de tweede helft is één derde eiwitvrij medium en twee derde pbcs.

Breng de suspensie over naar een steriele buis van 15 milliliter en incubeer deze gedurende 15 tot 20 minuten in een incubator op 37 degrees Celsius totdat er een duidelijke scheiding ontstaat tussen de bovenste en onderste lagen. Breng de bovenste laag voorzichtig over naar een nieuwe steriele buis van 15 milliliter, voeg 10 milliliters vers RPMI toe en centrifugeer bij 370 to 430 GS gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant.

Beoordeel nu de parasitemie en het ontwikkelingsstadium via een dun bloeduitstrijkje en onderzoek dit onder een lichtmicroscoop zoals eerder beschreven. Pas de P RBC-suspensie die is verkregen na plasmagel-flotatie aan naar 1 × 10⁸ P RBC's per µL in een nieuwe 1,5 mL buis. We suspenderen de RBC's bij 5% hematocriet in acridine oranje of ethidiumbromide met een eindconcentratie van 20 µg/mL en PRP tegen 10% van het totale volume.

Bereid op dezelfde wijze de volgende controles voor: niet-geïnfecteerde rode bloedcellen en PRP en PRBC met PPP, om de rol van bloedplaatjes bij de klontering van de PBC vast te stellen. Breng de suspensie nu over naar een schroefdopflacon van twee milliliter. Plaats de flacon onder zachte agitatie door te rollen bij 10 tot 12 RRP bij kamertemperatuur, waarbij op intervallen van 15 tot 20 minuten monsters worden genomen gedurende een totale tijd van 120 minuten om de vorming van klonters te controleren.

Pipetteer 10 µL van het monster op een objectglas en dek dit af met een dekglas om het onder fluorescentie te onderzoeken. Een klont wordt beschouwd als een aggregaat van drie of meer geïnfecteerde erytrocyten. In dit experiment werden ongeveer 70% van de rijpe stadia van p FALs parem geanalyseerd na verrijking door plasmagel-flotatie. Klonten zijn onder de microscoop gemakkelijk te herkennen, zowel onder gewoon licht als onder fluorescentie. Ze verschijnen als celaggregaten en onder fluorescentie als groene of rode vlekken.

Wanneer respectievelijk gekleurd met acridine oranje of ethidiumbromide, neemt de grootte van de clusters aanzienlijk toe tot een gemiddelde van meer dan 15 pbcs per cluster na incubatie gedurende 120 minuten, waarbij sommige clusters talrijke pbcs per cluster bevatten die visueel niet geteld konden worden. De frequentie van het klonteringsfenotype wordt berekend als het aantal geïnfecteerde cellen aanwezig in clusters per 1000 geïnfecteerde cellen, geteld in dubbele assays.

Na het bekijken van deze video heeft u nu een duidelijk inzicht in het uitvoeren van een assay voor plaatjesgemedieerde klontering van Plasmodium falciparum. Let erop dat u de bloedplaatjes niet activeert door schokkerige bewegingen en temperatuurschommelingen. Deze assay kan ook worden toegepast om de plaatjesgemedieerde klonteringsassay bij ernstige malaria te meten.