De bouw van een Low-budget Laser axotomy Systeem om Axon Regeneration Study in C. elegans

Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe een laserablatiesysteem moet worden geassembleerd en uitgelijnd voor het bestuderen van axonale regeneratie in CL gans. Dit wordt bereikt door eerst een laser-gland Thompson polarisator, een halfgolfplaat, een draaispiegel, een periscooprail en een railspiegel op een breadboard te monteren. De volgende stap van de procedure is het uitlijnen van de laserstraal op de uitgaande straal van de condensorlens van de microscoop.

Vervolgens wordt de lens van de laserstraaluitbreider gemonteerd, uitgelijnd en gepositioneerd om de laserstraal te centreren en deze divergentievrij te maken. De laatste stap van de procedure is om de laserablatieplek congruent te maken met de beeldfocus door middel van fijne aanpassingen. Uiteindelijk is het mogelijk om met de diffractiebeperkte laserstraal axonen van een halve micron nauwkeurig door te snijden met minimale collaterale weefselschade, zelfs wanneer er sprake is van een imperfecte XY NC-uitlijning.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals femtosecondelasers, is dat deze met een prijs van 15.000 relatief goedkoop is. De methode is relatief onderhoudsvrij en maakt zeer nauwkeurige axonsectie mogelijk. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de axonregeneratie van de zeepijpworm, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals vliegen, zebravissen, muizen, het perifere zenuwstelsel en in vitro cellen.

In principe elke cel die zich binnen 30 tot 50 µm van het oppervlak bevindt. Begin met de componenten op het breadboard en bout de laserperiscoophouder en de verhoogde railssteunen vast. Dit systeem maakt gebruik van een klasse 3B laser die uw ogen gemakkelijk kan beschadigen, dus neem de laserveiligheid serieus.

Bespreek met iemand van uw lokale vakgroep natuurkunde hoe u veilig met open laserstralen kunt werken. Zet de laser tijdens het uitlijningsproces altijd op het laagste vermogen. Wanneer u door de oculairs kijkt, dient u er zeker van te zijn dat de laser mechanisch is afgesloten en is uitgeschakeld.

Positioneer nu de microscoop: richt deze eerst uit met de as van de rail. Richt hem vervolgens uit met de doorgelaten lichtbundel van de condensorlens van de microscoop. Richt tenslotte beide uiteinden van de rail uit op de condensorbundel met behulp van een instelbare diafragma of lens die aan de rail is bevestigd.

Gebruik een waterpas en laboratoriumkrikken om de hoogte van de rail aan te passen voordat u verder gaat. Zorg ervoor dat beide uiteinden van de rail zijn uitgelijnd. Controleer vervolgens of de laserstraal door de gland, de Thompson-polarisator en de halfgolveplaat gaat en niet tegen de randen slaat tijdens het draaien.

De halfdoorlatende plaat wordt gebruikt om het vermogen van de laser aan te passen, terwijl alle componenten stevig op de optische tafel zijn bevestigd. Zet de laser aan, stel de pulsfrequentie in op 100 in continue modus en verminder het vermogen tot een minimum met behulp van de halfdoorlatende plaat. Gebruik een post-it of lenspapier om de laserstraal zichtbaar te maken.

Breng nu de laserstraal vanaf het breadboard omhoog. Stel de kinematisch gemonteerde spiegels in volgorde vanaf de laser af en fixeer deze om de straal naar de spiegel te leiden die aan het uiteinde van de verhoogde rail is gemonteerd. Wanneer dit is voltooid, moet de laserstraal ongeveer in het centrum van de spiegels zijn uitgelijnd, en moeten de spiegels ongeveer 45 graden ten opzichte van de as van de laserstraal zijn georiënteerd voordat de laserstraal wordt uitgelijnd met de doorgelaten lichtstraal van de microscoop.

Verwijder of open alle ND-filters en diafragma's in de tussenmodule. We beginnen nu met de meest kritische stap om axonen nauwkeurig door te snijden zonder overmatige collaterale schade. We gaan de laser precies uitlijnen op de x-, y- en z-as bij het laagste laservermogen om de kleinste ablatiespot te verkrijgen.

De laser en de doorgelaten lichtbundels kunnen gelijktijdig tegen papier worden waargenomen. Plaats ter beginfase het papier nabij de poort van de microscoop. Begin nu met het uitlijnen van de laser met behulp van de grove instellingen op de spiegel bovenop de periscoop en de spiegel aan het uiteinde van de rail.

Plaats een vel papier tussen de uitgelijnde condensorlens en de open objectieftorens. Gebruik de fijnafstellingen op de spiegelrail om de laserstraal verder uit te lijnen met het midden van de grotere doorgelaten lichtbundel. Zet de microscoop nu vast met klemmen.

Aanvullende stappen voor het beoordelen van de uitlijning van de laser zijn te vinden in het geschreven manuscript. Dubbele Galileïsche straaluitbreiders moeten worden geïnstalleerd om de laserstraal van 300 micron 33 keer uit te breiden, zodat de achteropening van het 10 millimeter objectief wordt gevuld. Begin met het monteren van de vier lenzen op dragers.

Bevestig vervolgens de lenzen aan de rail zodanig dat ze zich allemaal op dezelfde optische as bevinden en exact loodrecht op de laserstraal staan. Zet de laser aan en stel deze in op het minimumvermogen en op de continue modus. Pas de uitlijning van de straal door elke lens grofweg aan.

Gebruik papier om de straal zichtbaar te maken. Zet de laser nu uit. Plaats een veiligheidssluiter op de laser en verwijder de microscoop uit het pad van de laserstraal.

Zet de laser weer aan en visualiseer deze tegen een nabijgelegen muur. Gebruik de fijninstelling van de lenzen om de bundel uit te breiden. Stel vervolgens de laatste twee kinematisch gemonteerde spiegels af om de bundel uit te lijnen tot een cirkel van uniforme helderheid op de geschatte positie van de achteropening van het objectief.

Bekijk de grootte en uniformiteit van de bundel tegen papier. Stel vervolgens de bundel in op nulconvergentie door te observeren hoe de bundelgrootte verandert naarmate het papier verder van de lens wordt bewogen. Schakel de laser uit en sluit het mechanische sluitergedeelte.

Schuif de microscoop met behulp van de vaste klemmen terug in het pad van de laserstraal om de juiste uitlijning te bepalen. Plaats de klemmen aan de vrije zijde van de microscoop, maar draai ze nog niet vast. Zet nu de laser aan.

Verwijder de veiligheidssluiter en draai de objectiefrevolver naar een open positie met behulp van papier op de tafel; een uitgebreide en uniforme laserstraal gecentreerd op de doorgelaten lichtstraal van de condensor moet zichtbaar zijn. Als de stralen niet gecentreerd zijn, centreer deze dan door de microscoopklemmen te versoepelen en de microscoop voorzichtig te verschuiven. Sluit nu de veiligheidssluiter en zet de laser in de trigger-modus.

Draai het 60-keer objectief op zijn plaats. Neem nu een beeld op van de oppervlaktekrasjes op een target-objectglas. Verwijder de veiligheidssluiter, activeer de ablatielaser en stel het laservermogen in voor de minimale ablatiespot.

De spot moet cirkelvormig zijn en zich binnen vijf tot 10 microns van het midden van het beeld bevinden, het centrum van de ablatiespot. Met behulp van de fijne instellingen van de kinematisch gemonteerde railspiegel moet de spot gecentreerd en het bundelprofiel uniform worden gehouden, waarbij het noodzakelijk zal zijn om de railspiegel en de bovenste periscoopspiegel iteratief af te stellen. Evalueer de Z-focus van de laser door de focus systematisch in stappen van één micron omhoog en omlaag te bewegen en bij elke stap de ablatielaser te triggeren.

Als de bundel correct is uitgebreid en uitgelijnd en de convergentie juist is ingesteld, dan moet de ablatie maximaal zijn in de beeldbrandpuntsafstand en zwak of helemaal niet één micron boven of onder het brandpunt. Als de maximale ablatieplek zich boven of onder het beeldbrandpunt bevindt, moeten de laatste aanpassingen aan de Z-focus van de uitgebreide bundel worden gemaakt door lens L3 van de Galileïsche telescoop te verplaatsen totdat de laserablatie congruent is met het beeldbrandpunt. Nematoden werden gemonteerd op een aangepast objectglas en axonen werden geablateerd met behulp van het geconstrueerde systeem Laser exo somy; time-lapse imaging van axonale regeneratie was zeer robuust.

Met behulp van een gemotoriseerde tafel was het mogelijk om routinematig en nauwkeurig vijf axonen in vijf verschillende dieren te snijden en te beelden op één enkele objectglas. De beeldvormingstijd voor de axonen was hierbij de limiterende factor.

Ongeveer 10% van de experimenten resulteerde in time-lapsefilms van hoge kwaliteit. De overige experimenten leverden allemaal goede gegevens op, maar waren esthetisch minder aantrekkelijk vanwege kleine schokbewegingen van de worm die over het algemeen na vijf tot acht uur immobilisatie begonnen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het altijd belangrijk om de uitlijning van de laser in de x-, y- en z-as nauwkeurig te evalueren.

Het meest voorkomende probleem bij het proberen door te snijden van axonen is collaterale schade of het volledige onvermogen om axonen door te snijden, en dit komt bijna altijd door een verkeerd uitgelijnde laser. Dit laserablatiesysteem en deze techniek voor het visualiseren van axonale regeneratie in c Agains stellen u in staat om routinematig het effect van elke genetische mutatie op axonale regeneratie te analyseren. NCL Agains.