De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Dit protocol biedt een in vitro strategie voor het afleveren van stamcellen vanuit chitosan-microsferen in een collageengel-steiger, inclusief oogsten en cultiveren. De primaire adipocytenstamcellen worden vervolgens geëmulgeerd en hersteld in een preparaat van chitosan-microsferen. Zaai daarna de stamcellen op de chitosan-microsferen en cultiveer deze in een membraancultuurplaat-insert met een poriegrootte van acht micron om een CS-geladen CSM te produceren; meng tot slot het microsfeer-afleversysteem met een driedimensionale collageengel-steiger.

Uiteindelijk biedt dit CSM-systeem potentieel voor gebruik in de regeneratieve geneeskunde en bij geneesmiddelentoediening. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals celinjectie of micro-encapsulatie is het vermogen van cellen om zich aan een dragermateriaal te hechten en te overleven na de initiële toepassing. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat esan-microsferen een inherente statische lading hebben.

Het laden van cellen over een bed van microsferen zal uitdagend zijn zonder ze te verstoren. Snijd perineaal en epideraal vetweefsel uit en was dit, maal het weefsel fijn en breng vervolgens één tot twee gram over in 25 milliliter HBSS met 1% FBS. Verzamel na centrifugatie de vrij drijvende laag vetweefsel in een erlenmeyer van 125 milliliter.

Voeg 25 milliliters collagenase type twee toe en incubeer de reactie op een orbitale schudker. Verwijder nu voorzichtig de vloeibare fractie onder de olie- en vetlaag en filtreer deze opeenvolgend door nylon maasfilters van 170 microns. Oogst de cellen door centrifugatie na twee wasbeurten met 25 milliliters.

HBSS Resus, resuspendeer het pellet in 30 milliliters aangevuld mesen pro growth medium. Verdeel de gezuiverde adipogene stamcellen over twee T 75 kweekflessen en vermeerder de A SC-preparatie in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 degrees Celsius. Dit CSM-protocol is een water-in-olie-emulgatieproces dat gebruikmaakt van een ionische coer-techniek.

Emulgeer zes milliliters van een chitosan-waterige oplossing in 100 milliliters van een mengsel van de oliefase door gelijktijdig met een overhead-roerer en magnetische roerder in tegenovergestelde richtingen gedurende één uur te roeren tot een stabiele water-olie-emulsie is ontstaan; voeg elke 15 minuten gedurende vier uur 1,5 milliliters 1% kaliumhydroxide in n-octaal toe. Na voltooiing van de ionische cross-linking-reactie wordt de oliefase langzaam afgeschonken en worden de sferen onmiddellijk toegevoegd aan 100 milliliters aceton. Was de sferen met aceton totdat de oliefase volledig is verwijderd.

Droog vervolgens de teruggewonnen sferen in een vacuüm. Onttrek het vocht en bepaal de gemiddelde CSM-deeltjesgrootte, het oppervlak per milligram en het eenheidskubieke volume met behulp van een deeltjesgrootte-analyser. Ga verder door de CSM drie keer te wassen met steriel water om resterende zouten te verwijderen.

Steriliseer nu de CSM-preparaat met absolute alcohol voor gebruik in cel-experimenten in een glazen buis van 50 milliliter, meng vijf milligram microsferen met één milliliter 0,5% TNBS-oplossing en incubeer vier uur lang bij 40 °C. Voeg vervolgens drie milliliter zes normaal zoutzuur toe en incubeer twee uur lang bij 60 °C. Nadat de monsters zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, worden vijf milliliter gedeïoniseerd water en 10 milliliter diethylether toegevoegd.

Om het vrije TNBS te extraheren, wordt een aliquoot van vijf milliliter van de waterige fase verwijderd en 15 minuten lang in een waterbad verwarmd tot 40 °C om eventuele resterende ether te verdampen na afkoeling tot omgevingstemperatuur. Verdun dit met 15 milliliter water voor analyse met een spectrofotometer. Meet de absorbentie van de bereide chitosan-microsferen bij 345 nm met TNBS als blanco.

Meet daarnaast het chitosan dat voor de bereiding van de CSM is gebruikt. Bereken nu het aantal vrije aminogroepen van de CSM ten opzichte van het totale aantal aminogroepen in het chitosan. Laat vijf milligram van de gesteriliseerde CSM een nacht equilibreren in steriel HBSS.

Breng de CSM over naar een membrane-insert van acht micron voor 24-wells kweekplaten. Nadat de CSM zijn bezonken, wordt het HBSS voorzichtig afgezogen. Voeg nu 300 microliter groeimedium toe aan de binnenzijde van de insert en 700 microliter groeimedium aan de buitenzijde van de insert. Resus.

Suspendeer de uit vetweefsel afgeleide stamcellen in 200 µL groeimedium en zaai deze op het CSM in de kweekplaat. Incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 °C. Verplaats het met SC beladen CSM naar een steriele microcentrifugebuis zonder de cellen die in het insertmembraan zijn gemigreerd te verstoren.

Verwijder nu het resterende medium en voeg 250 µL vers groeimedium toe aan elke buis. Voeg 25 µL MTT-oplossing van 5 mg/mL toe en incubeer gedurende vier uur. Verwijder het medium en voeg 250 µL dimethylsulfoxide toe; vortex om het formazaancomplex te solubiliseren en centrifugeer de CSM bij 2.700 ×g gedurende vijf minuten.

Meet de absorptie van het supernatant bij 570 nanometer met 630 nanometer als referentie. Bepaal vervolgens het celaantal geassocieerd met de CSM relatief aan de absorptiewaarde verkregen van bekende aantallen levensvatbare A SC. Meng vijf milligram van een met A SC geladen CSM met 7,5 milligram per milliliter type I collageen geëxtraheerd uit ratten.

Staartpees, stel de pH bij naar 6.8 met behulp van twee normaal natriumhydroxide en giet dit in een kweekplaat. Plaats dit om te fibrilleren en breng het vervolgens over naar een 12-wells plaat en incubeer gedurende 30 minuten. Vernieuw het medium voor de collagen A-S-C-C-S-M gels vervolgens om de dag tijdens de incubatieperiode.

Monitor daarnaast de release en migratie van cellen vanuit de CSM naar de gel met behulp van standaard microscopietechnieken. Het volgende voorbeeld beschrijft de in vitro strategie om adipose-afgeleide stamcellen vanuit chitosan microsferen in een collageengel-scaffold te brengen. SEM- en TEM-beelden duiden op een preparatie van poreuze CSM van uniforme grootte.

Incubatie van de microsferen met primaire adipose-afgeleide stamcellen laat 4 000 cellen per milligram CSM calcium am zien. Kleuring van een SC toont verspreiding over de CSM met filopodia die zich uitstrekken in de poreuze spleten van de microsfeer. Wanneer de celbeladen CSM werd gemengd met de collageengel, migreerden de cellen in de gel en konden zij in de loop van de tijd worden gevolgd.

De implicaties van deze techniek strekken zich onmiddellijk uit tot de therapie bij massaal en chronisch weefselverlies. Bovendien heeft dit behandelingsregime een veel groter potentieel vanwege de veelzijdigheid om te worden geïntegreerd met een verscheidenheid aan cellen en/of biomaterialen die worden gebruikt om verschillende graden van zacht weefsel- en hartweefselverlies te behandelen. Deze methode kan inzicht bieden in de toediening van gastheercellen.

Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals injectables, voor de toediening van therapeutische geneesmiddelen en de ontwikkeling van hybride systemen om zowel cellen als therapeutische geneesmiddelen gelijktijdig toe te dienen.