Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Hallo, ik ben Tim Duso van Agriculture and AgriFood Canada. In deze video demonstreren we een protocol voor het bepalen van de aanwezigheid en overvloed van specifieke micro-organismen in een complexe klinische of milieu-monster met behulp van een Bio-Plex-instrument. Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende polystyreenkralen die chemisch gekoppeld zijn aan een soortspecifieke oligonucleotide-sonde.

Er wordt een amplicon uit het monster gegenereerd met behulp van universele PCR-primers, waarna het amplicon wordt gehybridiseerd aan de probe-gekoppelde beads. Met het BioPlex-instrument worden twee signalen gegenereerd. Eén signaal identificeert de bead en het andere kwantificeert het hybridisatiesignaal.

Het algemene doel van de procedure is om op een snelle en semi-kwantitatieve manier een profiel van de microbiota van belang te bepalen. We hebben deze techniek toegepast om bacteriële profielen in vaginale swabs te bepalen en de gegenereerde gegevens te gebruiken voor het diagnosticeren van bacteriële vaginose, een klinische aandoening die wordt gekenmerkt door een verandering in de microbiota waarbij lactobacillus-organismen minder prevalent worden en andere organismen, zoals Gardnerella, vais en apoian vae, detecteerbaar worden in vaginale swabs. Het is echter belangrijk om rekening te houden met het feit dat deze techniek kan worden toegepast op elke andere microbiota waarvoor een snelle multiplex-assay gewenst is.

Laten we beginnen met een beschrijving van de werking van de procedure. Een microbiële profiel wordt gegenereerd door een proteïne- en coatinggen chaperone in 60 van alle organismen die aanwezig zijn in een DNA-extract van het watje te amplificeren. Een van de universele amplificatie-primers is gemodificeerd door de toevoeging van biotine, evenals de inclusie van fosfaatgemodificeerde basen.

Aan het 5'-uiteinde wordt het amplicon enkelstrengs gemaakt met behulp van T7-exonuclease, dat uitsluitend de antisense-streng afbreekt. Omdat de sense-streng wordt beschermd door een fosfaatgemodificeerde PCR-primer, worden oligonucleotide-sondes die complementair zijn aan de resterende streng covalent gekoppeld aan fluorescerende polystyreenbolletjes. Aangezien elke unieke kleur bolletje een sonde bevat die een ander organisme detecteert, kunnen tot honderd verschillende bolletjes voor één enkel monster worden gebruikt.

Het enkelstrengs PCR-product van het vaginale swab wordt gehybridiseerd met een mengsel van gekoppelde probes op beads, dat probes bevat voor alle relevante organismen. Er wordt een fluorescente reporter, FICO ethin, toegevoegd die via een strep din-conjugaat bindt aan de gebiotinyleerde probes. Ten slotte wordt het hybridisatiemengsel geanalyseerd op een Luminex- of BioPlex-instrument, waarmee elke bead individueel wordt onderzocht op identiteit en hybridisatiesignaal.

De resultaten van deze analyse wijzen op de aanwezigheid van specifieke micro-organismen en de intensiteit van het hybridisatiesignaal correleert met de abundantie van dat organisme. In het monster kan de aanwezigheid van BV-gerelateerde organismen worden gebruikt om bv te diagnosticeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de gramkleuring, is dat er informatie wordt gegenereerd over de aanwezigheid van specifieke micro-organismen en hun abundantie.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Jennifer Town, een onderzoeksassistent in ons laboratorium. Resuspendeer de microsferen door ongeveer 20 seconden te vortexen. Breng 400 µL microsferen over naar een eppendorfbuisje en centrifugeer op 14.000 ×g gedurende één minuut; verwijder en gooi het supernatant weg. Suspendeer de microsferen in 50 µL 0,1 M MES pH 4,5.

Voeg één nmol capture-oligo toe aan de microsferen en meng door te vortexen. Voeg 2,5 µL verse EDC-oplossing toe aan de microsferen. Incubeer de reactie 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.

Gooi de eerder bereide EDC-oplossing weg en bereid een vers monster van 10 mg/mL EDC in water. Voeg, zoals hierboven beschreven, opnieuw 2,5 µL verse EDC-oplossing toe aan de microsferen en vortex vijf seconden. Incubeer opnieuw gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.

Was de kralen door één milliliter 0,02% Tween 20 toe te voegen, vortex om de kralen opnieuw te suspenderen en centrifugeer bij 14.000 ×g gedurende één minuut; verwijder en gooi het supernatant weg. Was de kralen opnieuw door één milliliter 0,1% SDS toe te voegen. Suspendeer de kralen in 100 µL TE-buffer.

Tel de kralen in een hemocytometer om de voorraadconcentratie te bepalen. Bereid een microsfeer-mastermix voor door elke kraal te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 100 beads per µL in TE-buffer. Pool de gekoppelde kralen volgens de gewenste plex van de assay. Bewaar de microsfeer-mastermix bij 4 °C in het donker. Dit mengsel kan maandenlang worden bewaard indien het onder deze omstandigheden wordt gehouden. Genereer het PCR-product voor elk monster.

Voeg de fosforlaat- en biotine-gemodificeerde 5'-primerset onmiddellijk na voltooiing van de PCR toe. Voeg twee µL T7-exonuclease toe aan elke PCR-buis en incubeer 40 minuten bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van deze incubatie 12,5 µL 0,5 M EDTA pH 8,0 toe aan het mengsel.

Dit geeft een totaal van ongeveer 64,5 µL enkelstrengs PCR-product. Resuspendeer de Bend Microsphere master mix met een pipet. Breng een passende hoeveelheid over in een eppendorfbuisje.

Sluit de buis af en soniceer gedurende twee minuten in een sonica waterbad. Verdeel 17 µL van het enkelstrengse PCR-product over de juiste putjes van een 96-well plaat met laag profiel en voeg aan elk putje 33 µL van het resuspenderde gesoniceerde kraalmengsel toe.

Dek de plaat af met een siliconen deksel en tik deze aan. Plaats de plaat voorzichtig in de thermocycler met een programma van 95 °C gedurende vijf minuten, 60 °C gedurende 10 minuten, en een hold- of pauze-stap van 60 °C gedurende vijf minuten. Beëindig en start het programma.

Maak een verse strep Aden FICO Ethin-oplossing. U heeft 25 µL per well nodig. Maak strep en FICO ethin door de stam te verdunnen tot 1 mg/mL.

Verdun tot 20 microgram per milliliter met één keer tmac-buffer. Wanneer de thermocycler de hold-stap van 60 °C bereikt, open dan het deksel, verwijder de siliconen afdekking en voeg de strep din FICO ethin-oplossing direct toe aan elke well. Plaats de siliconen afdekking terug, sluit het deksel van de thermocycler en hervat het programma.

Wanneer het programma is voltooid, haal je de plaat eruit en breng je deze snel over naar het Bio-Plex-apparaat om af te lezen. De plaat moet binnen 10 minuten worden uitgelezen. Lees de plaat af bij 60 graden.

Zorg ervoor dat de Bio-Plex is voorverwarmd tot deze temperatuur. Hier worden de resultaten getoond van de overeenkomstige gramkleuringen en Luminex-profielen van longitudinale monsters van één individu op tijdstip nul. De gramkleuring is consistent met een klinische diagnose van BV, en dit wordt bevestigd door een Fiveplex Luminex-assay die positieve hybridisatiesignalen laat zien voor BV-geassocieerde organismen, waaronder Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae en Prevotella bivia.

Lactobacillus iners wordt naarmate de tijd vordert ook in lage concentraties gedetecteerd. Zoals blijkt uit gramkleuringen, gaat dit individu over van een BV-microbiota naar een normale microbiota. Luminex-analyse van dezezelfde monsters laat zien dat de abundantie van Gardnerella vaginalis piekt en afneemt, terwijl lactobacillus iners toeneemt en tegen het laatste tijdspunt het dominante organisme wordt.

Door deze methode voor microbiotaprofilering te gebruiken, wordt informatie gegenereerd over de aanwezigheid van specifieke organismen alsmede hun abundantie. Aangezien de methode gebaseerd is op sequenering, kan het ontwerp van de probes worden geïnformeerd door deep sequencing-analyse en kunnen micro-organismen die zijn geïdentificeerd via next generation sequencing-methoden op een snelle en relatief goedkope manier in monsters worden gevolgd. Het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben gegeven in hoe u een microbiële profiel van een monster kunt genereren met behulp van een Luminex- of Bio Plex-instrument.

We hebben u laten zien hoe u oligonucleotide-sondes kunt koppelen aan fluorescerende kraaltjes, enkelstrengs DNA kunt genereren uit een klinisch of milieu-monster, hybridisatie kunt uitvoeren en de resultaten kunt bepalen op een Luminex- of Bio Plex-instrument. Veel succes met uw experimenten.