Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

Het hoofddoel van het volgende experiment is om de aanwezigheid van specifieke bacteriën, zoals e coli, snel aan te tonen met behulp van innovatieve flu genische DNA-Zyme-probes. Ten eerste worden genische DNA-Zyme-probes gegenereerd door ligatie. Vervolgens worden bacteriën gekweekt om het aantal doelmoleculen te verrijken en wordt er een extracellulair mengsel bereid uit het supernatant.

Het ruwe extracellulaire mengsel wordt vervolgens gecombineerd met de DNA-zym-sonde. De interactie tussen de DNA-zym-sonde en de doelmoleculen resulteert in splitsing van de sonde, die vervolgens fluorescentie vertoont. Een fluorimeter meet de interactie tussen de sonde en het doelmolecuul als een toename in relatieve fluorescentie. De resultaten worden vervolgens geverifieerd met behulp van denaturerende polyacrylamidegelelektroforese-analyse.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van PCR- of antilichaamgebaseerde methoden is dat de procedure eenvoudiger is en makkelijker kan worden uitgevoerd. Hoewel deze methode is ontwikkeld met de modelbacterie e coli, kan deze worden toegepast voor de detectie van elke andere door voedsel overgedragen of nosocomiale bacteriële pathogeen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat zij mogelijk niet gewend zijn aan het hanteren van synthetische DNA-sondes en bacteriën. De procedure wordt voor dit protocol gedemonstreerd door Sergio Aguire, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium, en Monso Ali, een postdoctoral fellow.

R-F-D-E-C one is het uitgelichte DNA Zyme. Het bestaat uit de katalytische sequentie EC one, onderstreept in het zwart, en de substraatsequentie FS one, onderstreept in het groen; in het substraat bevindt zich een RNA-verbinding, aangegeven door de blauwe r, geflankeerd door een Fluor-gelabelde DT, aangegeven door de F, en een QUENCHER-gelabelde DT, aangegeven door de queue. RF SS one is een gescrambelde versie van RFD EEC one waarbij de katalytische sequentie EEC one gedeeltelijk is geschud in SS one, maar het FS one-gedeelte ongewijzigd blijft. RF DEC one en RF SS one worden gemaakt door template-gemedieerde enzymatische ligatie van het oligonucleotide FS one met oligonucleotide EC one of SS one in aanwezigheid van LT one als ligatietemplate om ruwe extracellulaire mengsels of cems voor te bereiden die als doelwit voor R-F-D-E-C one zullen dienen. Begin met het dispenseren van 2 mL LB in steriele 14 mL cultuurbuisjes met behulp van een pipetpistool.

Neem vervolgens met een steriele pipetpunt een enkele colony *E. coli* van een agarplaat en breng deze over in een kweekbuis met LB. Plaats de buisjes in een incubator ingesteld op 37 graden Celsius en schud deze na de incubatie 14 uur lang op 250 RPM. Om een inokulatiecultuur van 1% te genereren, worden twee milliliter vers LB in 14 milliliter kweekbuisjes gedoseerd, waarna 20 microliter van de bacteriële cultuur uit de vorige stap wordt toegevoegd.

Incubeer de buisjes bij 37 °C met schudden op 250 RPM totdat elke bacteriële oplossing een OD 600 van ongeveer één bereikt. Draag één milliliter van elke cultuur over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis en pellet de cellen door centrifugatie bij 11.000 G gedurende vijf minuten. Draag na het centrifugeren het heldere supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Bewaar het supernatant bij -20 °C. Indien het niet onmiddellijk wordt gebruikt om te bepalen of er een fluorescentiesignaal wordt gegenereerd door de interactie van de DNA-enzymen met het ruwe celextract, worden de monsters geanalyseerd via spectrofotometrie. Zet de fluorescentiespectrofotometer aan en stel de parameters voor gegevensverwerving in met excitatie bij 488 nanometers en emissie bij 520 nanometers.

Stel het instrument daarna zo in dat er gedurende één uur elke minuut metingen worden verricht. Was drie kwartskristalkuvetten eerst met gedestilleerd gedeïoniseerd water en vervolgens met 100% ethanol. Droog de kuvetten door er kort stikstofgas doorheen te blazen.

Label de cuvetten als C1 voor controle één, C2 voor controle twee en T voor de test. Overbreng vervolgens 24 µL gedestilleerd gedeïoniseerd water naar C1 en 24 µL van het bereide ruwe extracellulaire mengsel van E. coli naar C2 en T. Voeg 25 µL 2X RB toe aan elke cuvet en plaats deze in de fluorescentiespectrofotometer. Start met het verzamelen van fluorescentiegegevens; voeg na vijf minuten 1 µL 5 µM RFSS1 toe aan C2 en 1 µL 5 µM RFDEEC1 toe aan T en C1, waarbij u ervoor zorgt dat de fluorescentiemetingen niet worden onderbroken. Meng elke oplossing door te pipetteren en laat de reactie vervolgens doorgaan gedurende de rest van de acquisitieperiode.

Sla de gegevens op in Excel-bestandsformaat. Draag de gegevens vervolgens over naar een persoonlijke computer en gebruik Excel om een grafische afbeelding te maken. Gebruik dezelfde reactiemengsels als voor de analyse met Spectra.

Fotometrie kan worden gebruikt voor analyse via gelelektroforese. Verwijder na één uur acquisitie de cuvetten uit de spectrofotometer en breng de oplossingen over naar nieuwe microcentrifugebuisjes.

Stop de reacties door vijf µL 3 M natriumacetaat en 125 µL 100% ethanol toe te voegen. Meng elke oplossing door te vortexen en plaats de buisjes na de incubatie één uur in een vriezer op -20 °C. Centrifugeer de reactiemengsels bij 11.000 G gedurende 20 minuten bij 4 °C en verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet.

Droog de pellets gedurende 10 minuten met een DNA-concentrator. Voeg 20 µL gel-laadbuffer toe en vortex kort. Centrifugeer kort in een benchtop-centrifuge.

Laad vervolgens 10 µL van de reactie monsters per put in de 10% Dage-gel na de run. Verwijder de glasplaten en was deze grondig met kraanwater. Veeg de platen af met een Kimwipe om eventuele gelresten te verwijderen.

Scan de gelplaat op fluorescentie met een Typhoon-scanner. Analyseer de resulterende beelden met software voor beeldkwantificering om de gevoeligheid van het systeem te beoordelen. Seriële verdunningen van culturen worden gekweekt gedurende toenemende tijdsperioden.

Om de minimale incubatieperiode te bepalen die nodig is om een enkele bacterie te detecteren, worden 10 cultuurbuisjes voorbereid met twee milliliter LB. Inoculeer elke cultuur met 100 microliter van een glycerolstock van e coli met een concentratie van twee CFU per milliliter en incubeer bij 37 graden Celsius met schudden op 250 RPM gedurende 4, 8, 12, 16 en 24 uur. Oogst 300 microliter uit elk van de geïnoculeerde cultuurbuisjes, aangezien er mogelijk geen detecteerbare bacteriën aanwezig zijn in monsters die zijn geoogst op de tijdstippen 4, 8 en 12.

Laat de resterende cultuur 24 uur groeien om culturen die bacteriën bevatten te identificeren. Meet de OD 600 en precipiteer de cellen door centrifugatie bij 11,000 G gedurende vijf minuten. Breng het supernatant dat de CEMS bevat over naar nieuwe 1.5 milliliter microcentrifugebuisjes en bewaar deze bij minus 20 °C tot gebruik de volgende dag.

Inspecteer de culturen op groei. Slechts één of twee van de 10 culturen kunnen na inoculatie e coli bevatten en de overige buisjes zullen geen cellen bevatten. Gebruik de CEMS die op de aangewezen tijdstippen uit positieve culturen zijn teruggewonnen om splitsingsreacties met RFD EEC one voor te bereiden, analyseer de reactiemengsels met behulp van DAGE-gelelektroforese zoals eerder beschreven; zowel de RFD EEC one- als de RF SS one-probes werden geprepareerd door enzymatische ligatie van de DNA-zyme-gedeelten aan het substraat.

De interactie van FS one met CEM EEC en RFD EEC one of RF SS one werd vervolgens beoordeeld met spectrometrie. Zoals hier te zien is, produceerde R-F-D-E-C one een hoog fluorescent signaal na toevoeging van CEM ec.

In schril contrast produceerde R FS S one geen sterk fluorescent signaal. Zo wordt de fluorescentie-producerende functie van RFD EEC one, bij contact met CEM EC, gesequenced.

Specifiek om te verifiëren dat de waargenomen toenames in fluorescentie te wijten waren aan de splitsing van de RNA-binding. De reactiemengsels werden geanalyseerd door dage cleavage van RFD eec, waarbij 0,25 M natriumhydroxide naar verwachting 2D NA-fragmenten genereert: een vijf-prime fragment dat de Fluor behoudt en een drie-prime fragment dat de quencher behoudt. Zoals hier te zien is.

Het RFD EEC CEM EEC reactiemengsel produceerde inderdaad het verwachte splitsingsproduct. Bovendien splitste alleen UNC R-F-D-E-C en het vijf-prime fragment kon worden gedetecteerd via fluorescentie-imaging. Om de specificiteit van RFD EEC te onderzoeken, werden fluorescentie-assays uitgevoerd met CEMS die uitsluitend waren verzameld uit diverse andere gram-negatieve en gram-positieve bacteriën.

Het monster dat CEM EC bevatte, vertoonde een toename in fluorescentie. Het gebrek aan kruisreactiviteit met CEMS van de andere bacteriën geeft aan dat R-F-D-E-C one zeer selectief is voor e coli. Om de minimale kweekduur te bepalen die nodig is om een enkele e coli-cel te detecteren, werd e coli verdund tot 1 CFU per milliliter in 100 µL en gekweekt in groeimedium gedurende 4, 8, 12, 16 en 24 uur. De resulterende CEMS werden gemengd met R-F-D-E-C one en de splitsing werd geanalyseerd via dage, zoals hier getoond.

Een afbeelding van de Dage-assay geeft aan dat R-F-D-E-C één geen verwacht splitsingsproduct produceerde. Wanneer gereageerd met CEM. ECS verzameld na vier en acht uur groei, wat aangeeft dat een kweekduur van 12 uur nodig is zodra deze beheerst is.

Het belangrijkste aspect van deze techniek is dat de DA-enzymatische assay in 60 minuten kan worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Na deze ontwikkeling maakte de procedure de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van bioanalyse om allogene DNA-enzymen te verkennen voor de detectie van een breed scala aan bacteriële pathogenen.