Visualisatie van Caenorhabditis elegans Cuticle structuren met behulp van de lipofiele vitale kleurstof, DII

Het algemene doel van deze procedure is om de cuticula in transparante, levende sea elegance te visualiseren met behulp van de rood fluorescerende lipofiele kleurstof dye eye. Dit wordt bereikt door een populatie nematoden voor te bereiden voor kleuring. Vervolgens wordt verdunde dye eye aan de populatie toegevoegd en mogen deze incuberen.

Vervolgens worden de dieren uit de kleuringsoplossing gehaald. Fluorescentie-imaging van de met Dai gekleurde cuticula toont details op het oppervlak, waaronder reproductieve structuren van Ailey en Ann eye en andere externe morfologische kenmerken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor het visualiseren van de cuticula in dit transparante organisme, zoals directe imaging, fluorescentie, transgene expressie, antilichaamskleuring, elektronenmicroscopie en gelabeld tarwekiemagglutinine, is dat deze techniek eenvoudig uit te voeren is, relatief snel en goedkoop is, en een prachtige resolutie van cuticulaire structuren in levende dieren oplevert.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in vele vakgebieden die gebruikmaken van het model-systeem van C. elegans en de cuticula ervan, zoals celsecretie en de organisatie van de cuticula, de ontwikkeling van epidermale cellen, heterochrone genroutes, aangeboren immuniteit, de ontwikkeling van morfologische kenmerken en de evolutie van nematoden. De procedure zal worden gedemonstreerd door Robbie Schultz, een promovendus uit mijn laboratorium. Houd er bij het werken met D Eye rekening mee dat deze lichtgevoelig is.

Bescherm D eye altijd tegen licht door het in folie te wikkelen. Draag daarnaast handschoenen en een laboratoriumjas, aangezien DMF toxisch is en DAI een car is. Cyanide Dai is zeer krachtig.

Een standaard werkconcentratie is 30 µg/mL DII in M9, waarbij voor een enkele populatie slechts 400 µL van deze werkconcentratie nodig is. Begin met een plaat van 60 mm waarop niet-gecontamineerde nematoden zijn aangebracht. Was de dieren van de plaat in 1,5 mL 0,5% Triton X 100.

Kringel de vloeistof in M nine buffer voorzichtig in cirkelvormige bewegingen om alle larven en volwassen dieren los te maken, en breng het wassel vervolgens over naar een buisje van 1,5 milliliter. Centrifugeer de dieren onmiddellijk 30 seconden bij 2000 RRP M om de dieren op de bodem van het buisje te verzamelen. Verwijder zoveel mogelijk supernatant zonder de dieren te verstoren.

Wees voorzichtig en niet te gul. Was de dieren met 1 mL M9. Centrifugeer en verwijder het supernatant.

Herhaal de wasbeurt. Centrifugeer opnieuw en verwijder het supernatant. Voeg vervolgens 400 µL van 30 µg/mL Dai in M nine toe aan de buis.

Vortex de buis kort om de dieren opnieuw te suspenderen. Schud de buis vervolgens gedurende drie tot 16 uur bij 20 °C in horizontale positie bij 350 RPM in een lichtbeschermde omgeving. De timing van deze laatste stappen is van belang.

Ten eerste moet Triton X worden weggewassen voordat het lipiden verwijdert waaraan de dai bindt. Ten tweede moeten de dieren lang genoeg in de dye eye-oplossing worden gekleurd om een uniforme kleuring van de cuticula mogelijk te maken. Iets later moeten de dieren voldoende tijd krijgen om te herstellen op voedsel om ongebonden eye te verwijderen.

Centrifugeer de dieren aan het einde van de kleuring en verwijder de kleurstofoplossing. Was de dieren met één milliliter M9. Om ongebonden kleurstof te verwijderen, centrifugeert u de dieren en verwijdert u het supernatant.

Resuspendeer de dieren in 400 µL M9-buffer en giet ze op een bacterievrij gedeelte van een NGM-microplaat. Laat de dieren, na inzaaiing met OP50 E. coli, ten minste 30 minuten maar niet langer dan een dag in het donker herstellen, aangezien de fluorescentie van de kleurstof tijdens de herstelperiode vervaagt. De dieren moeten wegkruipen van de vloeistof met de kleurstof en naar het voedsel migreren.

Deze dieren zijn gemakkelijker in beeld te brengen omdat ze minder achtergrondfluorescentie hebben van vrije kleurstof in het oog. Begin met het klaarmaken van een agri pad op een objectglas. Om een uniforme dikte van het gebruikte agri pad te garanderen, worden twee spacers gebruikt.

Een spacer wordt gemaakt door twee stukken laboratoriumtape in lagen op een glazen objectglas aan te brengen. Spacers kunnen onbeperkt worden hergebruikt. Plaats vervolgens een schoon glazen objectglas in de lengte tussen twee spacer-glasplaatjes en pipetteer ongeveer 150 µL gesmolten vier agar.

Op het midden van de schone glazen objectglas. Bedek de gesmolten AER snel met een extra objectglas dat loodrecht over de AER en beide afstandhouders wordt geplaatst om een agarpad te vormen. Schuif het dekglas voorzichtig weg, waarbij het pad gecentreerd op de bovenkant van het montageglas blijft.

Pipetteer nu vijf µL nematode-anestheticum op het objectglas, monteer acht tot 12 dieren in het anestheticum en dek deze voorzichtig af met een decentraalglas. Observeer de dieren met een lichtmicroscoop of confocale microscoop uitgerust met ten minste een 40 x objectief en een TRITC-filter of een ander compatibel filter. Het fluorescentie-excitatiemaximum van dye eye is 549 nm en het emissiemaximum is 565 nm.

Voor gebonden stervens imaging is de beeldvorming het meest uitdagende deel van dit protocol. We laten zien hoe de dieren moeten worden gemonteerd voor beeldvorming, maar u moet adequaat getraind zijn in het gebruik van de compound- of confocale microscoop die u zult gebruiken. We hebben vastgesteld dat het gebruik van een objectief met een vergroting van ten minste 60 x optimaal is om de details die door de kleuringsmethode worden verlicht, op te lossen.

Alle afbeeldingen in deze sectie zijn gemaakt met een 63x objectief van post-embryonische C. elegans. Het oppervlak van de cuticula is jaarlijks gescheiden door circumferentiële groeven en in sommige stadia door longitudinale ribben, zogenaamde alae. Alle afbeeldingen in deze sectie zijn gemaakt met een 63x objectief van post-embryonische C. elegans.

Het cuticulaoppervlak bevat ringen die gescheiden worden door circumferentiële groeven en in sommige stadia longitudinale ribben die aley worden genoemd. Elk ontwikkelingsstadium heeft cuticulastructuren met verschillende samenstellingen en patronen, ribben of groeven van zowel aley als Aly, die fluorescent gekleurd worden afhankelijk van de samenstelling van het oppervlak.

Gedurende alle larvale stadia en volwassen stadia blijft de kleuring bij gebruik van deze dye-standing methode tot een dag na het herstel zichtbaar. Achtergrondfluorescentie in de vorm van spikkels wordt soms waargenomen, maar niet routinematig. Dit is de cuticula van volwassen mutante dieren die matige defecten in de organisatie van de cuticula vertonen.

Ailey-kammen zijn discontinu en supernumerair. Ailey-kammen zijn gefuseerd en vertakt of gevorkt, een veelvoorkomende transgene marker. Een dominant roll six-allel veroorzaakt draaiing van de cuticula, wat zichtbaar kan zijn in de ailey en ervoor kan zorgen dat de annuli een onregelmatig patroon vertonen.

Dai kleurt ook andere externe cuticulastructuren, waaronder de volwassen hermafrodiet, de vulva en de staartverheffing en waaier van het volwassen mannetje; dai kan ook subtiele defecten in de externe morfologie highlighten, zoals deze gevorkte staart, bij onvoldoende kleuring. Een kleuring van twee uur leidt bijvoorbeeld tot vlekkerige cuticulaire kleuring, hoewel omgevingsblootgestelde neuronen wel gekleurd kunnen worden. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vier uur worden uitgevoerd, exclusief de beeldvorming, mits deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u Caenorhabditis elegans kleurt met dai voor de observatie van de cuticula en andere externe morfologische structuren.