Een eenvoudige methode voor de Imaging Arabidopsis Met behulp van Leaves Perfluorodecalin als een Infiltratieve Imaging Medium

Het algemene doel van deze procedure is om de degradatie van biologische beelden, veroorzaakt door de luchtholtes in plantenbladeren, te minimaliseren om duidelijkere beelden te verkrijgen van levende cellen binnen het blad. Als het blad wordt gemonteerd in een waterig montagemedium en een fluorofoor wordt door een laser geëxciteerd, beperken veel ongevulde luchtholtes en veranderingen in de brekingsindex binnen het weefsel (weergegeven in oranje) de sterkte van het signaal uit de diepere weefsellagen in het resulterende beeld. Wanneer het blad in plaats daarvan wordt gemonteerd in perfluordecaline of PFD, is de resulterende laser-excitatie van de fluorofoor minder gedempt, wat een betere transmissie van geëmitteerde signalen mogelijk maakt.

Uiteindelijk levert het gebruik van scanning laser confocale microscopie met het PFD-montagemedium heldere beelden op van levende cellen in het plantenblad op een diepte die meer dan het dubbele is van wat mogelijk is bij gebruik van een waterig montagemedium. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals fixatie of het monteren van bladeren in waterige media, is dat het de refractie binnen het mesofyl vermindert en nauwkeurigere beeldvorming mogelijk maakt van levende cellen dieper in het blad, wat voorheen problematisch was. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de plantwetenschappen, zoals onderzoek naar het mesofyl, celbiologie en in vivo signalering, de kolonisatie van bladeren door pathogenen en interacties met pathogenen, waardoor deze methode inzicht kan bieden in de fundamentele plantbiologie.

Het kan ook worden toegepast op andere sterk brekende weefsels die rijk zijn aan luchtruimtes, zoals slakkenhuisjes of de gewervelde long. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. George Littlejohn uit mijn laboratorium To Mount Leaf. Monsters in PFD beginnen met het voorbereiden van een microscopische preparaatglasplaat met een gasdoorlatende pakking van polydimethylsiloxaan of PDMS. PDMS is een viscoelastisch polymeer dat kan worden gevormd om een kamer te creëren die is afgestemd op de experimentele vereisten.

Equilibreer de PFD met lucht door een klein volume PFD in een met lucht gevulde fles te schudden. Dit kan ook worden bereikt door lucht door de PFD te borrelen; giet vervolgens de PFD in een open petrischaal en laat een hele kiemplant of een uitgesneden blad vijf minuten op de vloeistof drijven. Het weefsel moet doorschijnend worden, wat doet denken aan gevitrificeerd weefsel.

Bladeren kunnen er donkerder of lichter uitzien dan vóór blootstelling aan PFD, afhankelijk van de lichtomstandigheden en de leeftijd van het gebruikte weefsel. Vul tenslotte de PDMS-kamer met geaereerde PFD en breng de weefselmonsters voorzichtig over van de incubatie-petrischaal naar de PDMS-kamer. Sluit het objectglas af met een dekglas en maak een afbeelding.

Afhankelijk van de experimentele vereisten werden maandbladbladeren vijf minuten geïncubeerd in een suspensie van recombinant groen fluorescent eiwit of GFP. Bij microscopische inspectie van de in PFD geïncubeerde bladmonsters blijkt dat de meeste luchtruimtes zijn gevuld met recombinant GFP gesuspendeerd in PFD. Het GFP is groen, en het rood vertegenwoordigt chlorofyl, autofluorescentie en begrenst de mesofylcellen.

Het is duidelijk dat het blad wordt ondergedompeld bij incubatie met PFD, maar dat er incidenteel luchtbellen kunnen achterblijven. Water vult het blad onder deze omstandigheden niet volledig. Hierbij worden opsys-bladeren die Venus tot expressie brengen, een variant van YFP die in het cytosol lokaliseert, geïncubeerd en gemonteerd in lucht, water of PFD laser scanning. Confocale microscopie van de monsters toont een voordeel van PFD ten opzichte van lucht en water, met een ongeveer tweevoudige toename in de beelduitdiepte.

Bij het vergelijken van PFD en water kan deze techniek, zodra deze onder de knie is, in vijf tot 10 minuten worden uitgevoerd indien dit correct wordt gedaan. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat perfluordecaline nagellak en Teflon oplost, maar compatibel is met siliconenvet. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe perfluordecaline als montagemedium kan worden gebruikt om de beeldvorming in cellen van plantenbladeren te verbeteren.

Vergeet niet dat hoewel perfluordecaline niet toxisch is, wij aanbevelen om standaard veiligheidspraktijken toe te passen bij het uitvoeren van deze procedure.