Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie

Het algemene doel van het volgende experiment is om lax Z-positieve cellen uit het cochlea van neonatale muizen te isoleren met behulp van flowcytometrie. Dit wordt bereikt door eerst een groot aantal muis-cochlea's in een relatief kort tijdsbestek te isoleren om de cellen levensvatbaar te houden en voldoende startweefsel te hebben. Als tweede stap worden de LAX Z-positieve cellen gedissocieerd en vervolgens gelabeld om het weefsel voor te bereiden op sortering.

De cellen worden vervolgens gesorteerd via flowcytometrie. De resulterende LAX Z high en lax low populaties kunnen daarna worden gebruikt voor verdere experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het onderzoek naar het oor, zoals wat de genprofielen of specifieke celpopulaties in het binnenoor zijn.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Taha Gen, een geneeskundestudent uit ons laboratorium. Vul eerst Petri-schalen van 35 millimeter met HBSS en plaats deze op een ijsblok. Gebruik vervolgens irisscharen om 12 tot 15 geëuthanaseerde postnatale axon, two laxy reporter- en wildtype-muizen van nul tot drie dagen oud te onthoofden.

Plaats de koppen in een Petri-schaal van 60 millimeter op een ijsblok. Gebruik vervolgens Dumont-pincetten nummer vijf en irisscharen om de onderkaak en tong uit de koppen te snijden, en snijd daarna door de schedelbasis ter hoogte van het palatum. Verwijder nu de bovenliggende huid van de schedel en doorsnij de schedelbasis door de schaar in te brengen vanaf het inferieure deel van het foramen magnum tot in het midden van het palatum.

Maak met de schaar een nieuwe incisie van de snijrand van het gehemelte naar het superieure aspect van de calver aan beide zijden. Wees voorzichtig om de otische capsule niet te beschadigen. Voltooi vervolgens de isolatie van het slaapbeen door 2 incisies onder een hoek van 45 graden te maken, beginnend bij het superieure aspect van het frame en magnum, uitlopend naar de coronale snede bij het harde gehemelte.

Plaats vervolgens de geïsoleerde slaapbeenderen in de 35 millimeter Petri-schalen met HBSS op het ijsblok en verplaats het ijsblok naar een steriele dissectiekap. Vul daarna een andere 35 millimeter Petri-schaal, ditmaal met PBS, en plaats deze op het ijsblok. Gebruik hiervoor twee nummer 55 pincetten.

Begin de microdissectie door voorzichtig de cortex, hersenstam en het cerebellum van het slaapbeen boven de otische capsule te verwijderen. Hak vervolgens, zonder de otische capsule te verwijderen, delen van de cochleaire capsule weg, beginnend bij de ingang van de vestibulo-cochleaire zenuw en verdergaand in de otische capsule. Nadat de basis van de cochlea is blootgelegd, trekt u voorzichtig het corti-orgaan en de omliggende weefsels naar buiten.

Verwijder vervolgens, beginnend bij de basis, het resterende spiraalganglion en de stria vascularis en breng het slakkenhuis over naar de Petrischaal gevuld met PBS. Pipetteer eerst 50 µL steriele PBS in het midden van één tot twee putjes van een niet-gecoate six-well kweekplaat. Breng vervolgens niet meer dan 20 axin, twee laxy slakkenhuizen over naar elke druppel PBS.

Verwarm vervolgens aliquots van 50 µL 0,125%trypsine ongeveer twee minuten voor in een waterbad van 37 °C. Voeg daarna de trypsine toe aan de cochlea, waarbij u er zorg voor draagt dat de schaal niet wordt geschud.

Incubeer de cochlea gedurende acht minuten bij 37 °C. Beëindig de trypsinisatie door 50 µL sojabonentrypsine-remmer aan elke druppel toe te voegen, en voeg vervolgens nog eens 50 µL volledig medium toe nadat de P 200 micropipet op 125 µL is ingesteld. Gebruik een stompe pipetpunt van 300 µL om de cellen voorzichtig 80 keer te tritureren, waarbij u er op let dat er geen bellen ontstaan.

Nadat elke druppel is getritureerd, wordt aan elk putje nog eens 200 µL volledig medium toegevoegd. Breng de cellen vervolgens door een cellenzeef van 40 micron naar een nieuw putje binnen dezelfde zesputjesplaat en transfer de cellen vanuit elk putje naar individuele standaard FACS-buisjes.

Voeg vervolgens 100 µL wild-type cellen toe aan elk van de drie buisjes, gevolgd door verdunning met 300 µL volledig medium voor alleen CUG. Voor de controle worden 10 µL axon, twee LAX Z-cellen verdund in 390 µL volledig medium. Draag de resterende axon twee LAX Z-cellen over naar fax-buisjes in 400 µL OT.

Incubeer de buisjes vervolgens 10 minuten in een bevochtigde incubator bij 37 °C en voeg 200 µL verdunde CUG toe aan elk overeenkomstig fax-buisje. Incubeer de cellen daarna 25 minuten in een bevochtigde incubator bij 37 °C, waarbij alle buisjes tegen licht worden beschermd. Bereid tijdens de incubatie van de cellen de kleuring voor door 10 mL vers bereide heaps plus FBS in een 15 mL buisje te doen en dit buisje op ijs te plaatsen.

Voeg vervolgens 1,8 milliliters van de ijskoude heap-oplossing toe aan elke fax-buis onder de steriele kap met de lichten uit om blootstelling aan licht te minimaliseren. Centrifugeer de cellen daarna gedurende vijf minuten bij 1200 RPM bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de pellets in 300 microliters volledig medium.

Voeg alle aliquoten voor het sorteermonster samen en voeg vervolgens propidiumjodide toe aan elke betreffende buis tot een eindconcentratie van 1 µg/mL. Plaats de cellen tenslotte, nadat ze zijn afgedekt, opnieuw op ijs. Stel de sorteerpoorten in door eerst 1000 events van de ongekleurde wildtype-cellen te verzamelen om de celdistributie op de forward versus side scatter-plot te bepalen.

Pas de parameters voor forward- en side-scatter indien nodig aan. Compenseer vervolgens met de ongekleurde wild-type, de PI-gekleurde wild-type en de CUG-gekleurde axon. Twee LAX Z-cellen.

Vul twee FACS-buisjes met 500 µL volledig medium. Start vervolgens de analyse met de wild-type PI-gekleurde en axon twee Lae CUG-gekleurde cellen; gebruik een gate om debris uit te sluiten op basis van de forward scatter versus side scatter plot. Sluit doubletten en aggregaten uit met behulp van de forward scatter height versus forward scatter area plot.

Sluit vervolgens PI-positieve dode cellen uit op basis van het plot van de forward scatter area versus PE sci five area. Stel voor elke gate-plaatsing een plot op van de forward scatter area versus cascade- of Pacific blue area. Analyseer 10.000 events uit de sorteerbuis met axon two laxy PI- en CUG-gekleurde cellen, waarbij alle gates worden gebruikt die zijn ingesteld met de wildtype-cellen op basis van de plots van de wildtype-cellen.

Maak gates voor cascade blue hoge cellen die minder dan 1% van het totaal aantal events vormen. De cascade Blue High Gates moeten nu ongeveer 15 tot 20% van de cellen in het Axon two laxy monster bevatten. Nadat deze axon two hoge cellen met behulp van de Axon two laxy celanalyseplot zijn bepaald, wordt er nu een gate gemaakt voor de minst fluorescente 15 tot 20% van de cellen met gebruik van de bovengenoemde gating-strategie.

Sorteer de cellen in de FACS-buisjes met volledig medium, waarbij de opvangbuisjes tijdens het sorteren in een kamer worden bewaard die is gekoeld tot 4 °C. Noteer het aantal cellen dat door de flowcytometer voor elke populatie is geteld in deze twee figuren. De side scatter-gebieden tegenover de forward scatter-gebieden van het gedissocieerde wild-type links en axon two LA Z rechts.

Cochleaire cellen worden getoond. Let op de gating van de verschillende groepen events met een veel grotere omvang dan de events dichter bij de Y-as, die zijn aangeduid als de debris-negatieve populatie. Doorgaans wordt in deze twee panelen 40 tot 45% debrisvrije cellen teruggewonnen uit zowel de wildtype- als de axin twee LAX Z-cochlea.

De forward scatter height tegenover de forward scatter area wordt gebruikt om doubletten uit het eerder gegate debris te sluiten. Negatieve populatiegebeurtenissen die afwijken van het verwachte lineaire verloop van de plot worden uitgesloten. Deze voorbereiding levert doorgaans 71,1% gebeurtenissen op binnen de aangewezen gate hier.

Propidiumjodide, gedetecteerd via het PE SCI vijfkanalsysteem, wordt gebruikt om dode cellen uit te sluiten, zoals te zien is in deze scatterplots. Ongeveer 95% van de gesorteerde cellen was levensvatbaar en nam geen PI op in deze panelen. Het Cascade blue-kanaal werd gebruikt om het fluorescerende substraat CUG te detecteren, zoals weergegeven in de figuur rechts.

Gemiddeld zijn de bovenste ongeveer 20% CUG-positieve cellen lae-high cellen, wat overeenkomt met ongeveer 15.000 axon, twee high cellen per 10 tot 12 dieren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u laxy-high cellen uit binnenoorweefsels kunt prepareren en isoleren met behulp van flowcytometrie, zowel voor cel-Turing-experimenten als voor experimenten zoals genprofilering.