Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door

Jane verzorgde de overdracht naar het Ontwikkelende Binnenoor van de Muis via in Vivo electroporatie door Ling Wang, Han Jang en John Burgandy, Oregon Hearing Research Center, Oregon Health and Science University. Oké. Mijn naam is John Burgandy. Mijn laboratorium bevindt zich bij het Oregon Hearing Research Center aan de Oregon Health and Science University.

Mijn naam is Ang. Ik ben een poster in het lab van John. Ik ben ook Ang in het lab van John als onderzoeksassistent.

Onze presentatie is onderverdeeld in vier delen. Het eerste deel betreft de ventrale laparotomie. We demonsteren anesthetisering op basis van sodium pentobarbital, hoe de adequaatheid van de anesthesie kan worden getest, cornea-bescherming, de voorbereiding van de operatielocatie, desinfectie, het datablad voor overlevingschirurgie bij muizen, de operatieruimte, de ventrale midline-incisie door de huid en de buikwand en de externalisatie van de uterine hoorns.

Deel twee betreft de trans-uteriene micro-injectie. We demonstreren de trans-illuminatie van het embryo, de heroriëntatie van het embryo, de micro-injectie, de fabricage van de pipet en de micro-injectie in de otis op embryonale dag 11.5 en embryonale dag 12.5. Deel drie betreft in vivo elektroporatie.

We demonstreren de plaatsing van paddle-elektroden en elektroporatie van de muis-occiput op embryonale dag 11.5. Deel vier bevat representatieve resultaten. We tonen de expressie van GFP in cochlea's in het late embryonale en vroege postnatale stadium.

Dit resulteerde uit in vivo elektroporatie van de otis met expressieplasmiden op embryonale dag 11,5. Deel één: ventrale laparotomie. De moeder wordt stevig vastgehouden door de huid achter de nek, de staart en het linker achterpootje vast te pakken. Na het afnemen van de buik met 70% ethanol wordt een intraperitoneale injectie van een anestheticum op basis van natriumpentobarbital toegediend.

De muis wordt gedurende vier tot vijf minuten in de eigen kooi geplaatst om het anesthesicum te laten inwerken. Er wordt gebruikgemaakt van knijptesten bij de voet en staart om de adequaatheid van de anesthesie te beoordelen. Deze moederen knippert in reactie op de staartknijp en heeft nog twee minuten nodig voordat ze niet meer reageert op nociceptieve prikkels.

Steriele oogzalf wordt aangebracht op de ogen om de hoornvliezen tegen uitdroging te beschermen. We bereiden de operatielocatie voor in een chemische zuurkast om de verspreiding van vacht en huidschilfers te minimaliseren. De vacht wordt met een fijn mesje geschoren om de huid over de buikwand bloot te leggen.

Het volledig verwijderen van de vacht bevordert de genezing van de incisie na de operatie. Desinfectie van de buikwand wordt bereikt door afwisselende bewegingen met 70% ethanol, Betadine en 70% ethanol. Veeg altijd van rostraal naar caudaal en gebruik telkens een nieuw chirurgisch wattenbolletje of een wattenstaafje.

Bij elke beurt beoordelen we de diepte en kwaliteit van de ademhaling tijdens de desinfectie om er zeker van te zijn dat het dier geen reactie vertoont. Na de tweede beurt met 70% ethanol hebben we het dier onmiddellijk met de ventrale zijde naar beneden op een steriel laken geplaatst en op een warmtepad gezet gedurende twee tot drie minuten om haar op te warmen. Dit is een geschikt moment om de preoperatieve gegevens in het logboek voor de overlevingschirurgie van de muis te noteren. We hebben ons gegevensblad voor de overlevingschirurgie van de muis als aanvullende informatie bijgevoegd.

Overweeg om het gegevensblad en uw protocol voor dierverzorging bij te voegen, zodat de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik kan zien hoe u de preoperatieve, operatieve en postoperatieve gegevens zult monitoren. We vullen voor elk chirurgisch subject één logblad in. Wij geven de voorkeur aan het uitvoeren van de chirurgie in een steriele omgeving, hoewel dit voor knaagdieren doorgaans niet vereist is.

Het werkoppervlak is gescheiden van de blower-motor en de plenumbehuizing, waardoor er geen trillingen worden overgebracht op de gebruiker. Voor de micro-injectie hebben we als aanvullende informatie een schema bijgevoegd van de wijzigingen die we hebben aangebracht in onze laminaire flowkast om in utero genoverdracht te vergemakkelijken; de essentiële wijzigingen zijn uitsparingen voor lage uitdaging en trackverlichting, verborgen stopcontacten voor de voedingskabels van instrumenten en een route voor hulpcircuits van de elektrische installatie. De chirurgische suite bestaat uit de elektrische lactated ringers IV-zak, een warmtebad, XY, Z-manipulator, stereofluorescentie-dissectiemicroscoop, glasvezellichtbron en chirurgische instrumenten.

Voetpedalen worden gebruikt om de micro-injector, de elektroporator en de focus te activeren. De chirurgische instrumenten voor de microscopie worden gesteriliseerd in een autoclaaf. Instrumenten moeten tussen de muizen door opnieuw worden gesteriliseerd met een glaskraalsterilisator of door de naaldvoerder opnieuw te autoclaveren.

Balli-scharen, ringtangetjes en vasculaire pincetten zijn de essentiële instrumenten. Maak een incisie in de ventrale middellijn, pak de huid vast met de vasculaire pincetten en exciseer het integument met de stompe scharen; breid de incisie uit tot 10 tot 14 Millimeters. Identificeer de witte avasculaire band van bindweefsel, de linea alba genoemd, en de ventrale middellijn van de buik; incideer de linea alba met de stompe scharen.

Zorg ervoor dat de darmen of de inguinale vetkussentjes niet worden ingesneden. Spoel de buikholte onmiddellijk met steriele, voorverwarmde lactaatringeroplossing. Controleer de incisieplaatsen in de huid en de buikwand op bloedingen.

Directe druk met stompe pincetten stelt kleine bloedingen, indien aanwezig, stil; externaliseer de rechter- en linker uterine hoorns met ringpuntpincetten. Pak de rechter uterine hoorn voorzichtig vast met één ringvormig uiteinde van het pincet en trek de uterus naar de midline-incisie. Gebruik uw vrije hand om de laterale zijde van de moeder voorzichtig te manipuleren om het vastpakken van de uterus te vergemakkelijken.

De pincet mag nooit worden gebruikt om de uterus samen te drukken en naar buiten te trekken. Aangezien dit de vasculaire structuur van de uterus of de embryo's kan beschadigen, wordt de procedure voor externalisatie herhaald voor de linker uterushoorn. Spoel de vers geëxternaliseerde uterushoorns onmiddellijk voorzichtig met voorverwarmde lactaat-Ringer-oplossing en plaats de abdominale vetkussentjes of de darmen, indien deze samen met de uterus naar buiten zijn gekomen, voorzichtig terug.

Dit komt niet vaak voor. Deel twee: uteriene micro-injectie. De moeder wordt onder de objectief met een grote werkafstand geplaatst en een flexibele glasvezellamp wordt tegen de baarmoederwand geplaatst.

De uterus wordt voorzichtig ingedrukt met een vinger van de vrije hand om de identificatie van de oriëntatie van het embryo te vergemakkelijken. Het licht van de glasvezelkabel moet op de laagst mogelijke intensiteit staan die nodig is om de oriëntatie van het embryo nauwkeurig te beoordelen.

Intens licht kan warmte overbrengen naar de uterus, wat complicaties kan veroorzaken. We houden de glasvezellamp en de uterus in één hand en gebruiken een vinger van de vrije hand om het embryo door middel van zachte palpatie te herpositioneren. In de volgende drie microscopy EC-clips demonstreren we dit, evenals de veelvoorkomende oriëntaties van embryo's die in de uterus worden waargenomen.

De kijker ziet het microscopische beeld dat wij zien tijdens transilluminatie; hoewel in zwart-wit, maakt transilluminatie van de uterus het mogelijk om de oriëntatie van het embryo in vivo vast te stellen. In dit voorbeeld staat het embryo op zijn kop, waarbij de ventrale zijde naar de kijker is gericht. Door de uterus heen en weer te bewegen, kunnen we de rechter- en linkerachterpoten, de staart en het cephalon van het linkeroog detecteren.

In dit voorbeeld staat het embryo opnieuw op zijn kop, maar is het ongeveer 90 graden gedraaid ten opzichte van de anterieur-posterieure as. Door de baarmoeder voorzichtig heen en weer te bewegen, kunnen we de peddelvormen zien die de linkerachterpoot en de linker voorpoot definiëren. De rhombencephalon is ook duidelijk zichtbaar.

Het embryo bevindt zich in een rechtopstaande positie met de linkerzijde naar de kijker gericht. De beginnende vierde ventrikel is waarneembaar als een heldere vlek in de ruitenhersenen. De linker oogkop, de linker voorpoot en de linker achterpoten zijn eveneens duidelijk zichtbaar.

Lichte druk op de baarmoeder heroriënteert de embryo's enigszins om detectie van de hoofdstam van de primaire kopader en de anterieure en posterieure vertakkingen daarvan mogelijk te maken, die respectievelijk met een wit en een zwart sterretje zijn gemarkeerd. Zoals we zullen zien, bevindt de Otis zich halverwege de anterieure en posterieure vertakkingen van de primaire kopader. De Otis zelf is niet zichtbaar door de baarmoeder via transilluminatie.

We tonen in twee opeenvolgende videomicroscopiefragmenten hoe het embryo opnieuw georiënteerd moet worden voor micro-injectie met behulp van de Otis-assistent. Het doel is om de embryonale kenmerken te identificeren die interpolatie van de locatie van de otis in het laterale hoofd mogelijk maken. In het geval van mesen is ons doel om het embryo van een dorsale naar een laterale positie te heroriënteren, zodat we de primaire hoofdader kunnen identificeren.

Het mesencephalon, de vierde ventrikel en de linker voorledemaat zijn duidelijk zichtbaar in dorsale positie. Lichte druk op de uterus verschuift de oriëntatie van het embryo van dorsaal naar lateraal. Het linker oog, het cephalon, het mesencephalon en de vierde ventrikel zijn duidelijk waarneembaar.

De primaire hoofdaderven en de posterieure aftakking hiervan, aangegeven met het asteriskteken, zijn ook duidelijk zichtbaar. De anterieure aftakking van de primaire hoofdaderven is niet duidelijk waarneembaar. Ons doel is opnieuw om het embryo zodanig te oriënteren dat de primaire hoofdaderven kunnen worden geïdentificeerd, maar onder een hogere vergroting die geschikt is voor uteriene micro-injectie.

De uterusvaten, de decidua-band en het linker oog zijn zichtbaar in dit laterale perspectief. Door voorzichtig druk uit te oefenen op de uterus verschuift de positie van het embryo, waardoor we het vierde ventrikel en het linker oog kunnen detecteren. De primaire hoofdader en de posterieure aftakking hiervan zijn gemarkeerd met het sterretje; de primaire hoofdader en de aftakkingen hiervan vormen de vorm van American football-doelpalen.

De otische blaas is niet zichtbaar door de baarmoeder, maar bevindt zich in het midden van de steunen. Lynn is begonnen met een injectiesequentie voor één embryo. Ze verlicht de baarmoeder via transilluminatie, heroriënteert het embryo voor een micro-injectie en brengt de micro-injectiepipet, gevuld met fast green, in het gezichtsveld.

De micro-injectiepipet is bevestigd aan een pipethouder die wordt vastgehouden door een X, Y, z micromanipulator. De magnetische standaard van de manipulator is bevestigd aan een stalen plaat met een Teflon-basis, waardoor de micro-injectiepipet moeiteloos grof kan worden gepositioneerd. De naald wordt op passende wijze naar voren bewogen met behulp van de knop van de voorwaartse micrometerregeling op de manipulator.

Gefabriceerde pipetten zijn essentieel voor traumatische micro-injectie in het vroege Otis-stadium van het muisembryo. We trekken dikwandige borosilicaatglas capillaire buisjes met een horizontale pipettentrekker. De resulterende pipet, getoond in A, wordt handmatig met een pincet gebroken op de positie met een buitendiameter van ongeveer 14 tot 16 micron, aangegeven door de pijl in B. De ruwe breuk van de pipet, getoond in C, is grillig en fragiel.

We schuinen de pipet onder een hoek van ongeveer 20 graden om de pipetpunt aan te scherpen, zoals te zien in Paneel D; de parameters voor het trekken en schuinen van microinjectiepipetten worden in de bijbehorende tekst vermeld. In de volgende twee videomicroscopieclips demonstreer we microinjectie in het otische cyste van de muis op embryonale dag 11,5 en 12,5. Ons doel is om uteriene microinjectie in de otische cysten van muizen op embryonale dag 11,5 te demonstreren.

Eerst injecteren we de otics zonder dat de uterus aanwezig is, om ondubbelzinnig te laten zien hoe een correct gericht injectiepunt eruitziet. Vervolgens demonstreren we een authentieke trans-uteriene micro-injectie. Voor deze eerste injectie werd de uterus volledig ingesneden om de viscerale zak te laten uitpuilen; de deciduale band boven de viscerale dooierzak werd verwijderd.

De placenta blijft aan de baarmoeder gehecht en het embryo is in leven. Terwijl de baarmoeder focaal is verwijderd, zien we het vierde ventrikel, de primaire hoofdadertje en de anterieure en posterieure vertakkingen daarvan, de pipet en de geschatte locatie van de cyste in het wit. Aan het begin van deze injectiesequentie wordt bloedstroom gedetecteerd in de vasculatuur van de viscerale dooierzak.

De pipet wordt door de viscerale dooierzak gevoerd en dai wordt geïnjecteerd in de osis note, het endolymfatische kanaal dorsaal en de positie van de otics in het centrum van de uprights. De otics bevindt zich halverwege de anterieure en posterieure takken van de primaire hoofdadder, uteriene micro-injectie in de embryonale dag 11.5 muiznotics vereist detectie van de primaire hoofdadder en ten minste één van de takken ervan om de locatie van de otic assist te schatten.

In dit diagrammatische voorbeeld is ons doel dat zowel de anterieure als de posterieure takken van de primaire hoofdadder worden gedetecteerd, waarbij het OUC-territorium in het wit is gemarkeerd. Een realistischere weergave van het embryo is er een waarbij de hoofdstam van de primaire hoofdadder wordt gedetecteerd samen met slechts één van de takken; in het getoonde voorbeeld is alleen de posterieure tak van de primaire hoofdadder zichtbaar, maar dat is voldoende om de locatie van de otica te interpreteren. De PT wordt door de baarmoeder naar voren gebracht en er wordt kleurstof in de otica geïnjecteerd.

We wachten 30 seconden zodat de kleurstof uit de vruchtzak kan wegvloeien, waarna de endolymfatische duct dorsaal en het vestibulum zichtbaar worden. We sluiten af met een beeld bij lage vergroting van het embryo waarvan we zojuist de cyste hebben geïnjecteerd om anatomisch perspectief te bieden in dit aanzicht, waarbij de vierde ventrikel, het linker oog en de uterusvascularisatie te zien zijn. We demonstreren trans- en microinjectie in de otische cyste van een muisembryo op dag 12 en microinjectie in de ontluikende vierde ventrikel van de rhomencephalon.

Door middel van transilluminatie kunnen we in dit linker lateraal aanzicht zowel de primaire hoofdader als het oog detecteren. De pipet wordt door de uterus in de otische blaas gebracht en de kleurstof wordt geïnjecteerd om het lumen te vullen. Om het vierde ventrikel te injecteren, roteren we het embryo 90 graden voor een dorsaal aanzicht van de rhomencefalon.

De geïnjecteerde linker cyste bevindt zich nu aan de linkerkant. De pipet wordt door de uterus bewogen en fast green gemengd met lor. Geconjugeerd dextran wordt in het vierde ventrikel geïnjecteerd.

Let op dat het geïnjecteerde volume kleurstof in vivo niet in de middenhersenen terechtkomt. De fluorescentie wordt na de injectie beoordeeld om de lokalisatie van dextran in het vierde ventrikel te valideren. Het embryo wordt vervolgens heroriënteerd van een dorsale naar een laterale positie.

De endolymfatische duct bevindt zich in dit laterale aanzicht net ventraal van het vierde ventrikel. In vivo fluorescentie valideert de lokalisatie van de dextraan in het vierde ventrikel. Bij de geboorte screenen we de pups op groene fluorescentie in het vierde ventrikel met behulp van epifluorescentie.

Microscopische dissectie van pups met groene fluorescentie in hun achterhersenen onthult een binnenoor dat tijdens de embryogenese is gemanipuleerd in deel drie: in vivo electroporatie. Na het vullen van de cyste met het expressieplasmid wordt de baarmoeder vers geïrrigeerd met voorverwarmde lactaat-ringersoplossing. Door transilluminatie kan de ODU-cyste centraal in het elektrodeveld worden geplaatst.

De metalen kop van de glasvezellamp wordt teruggetrokken van het oppervlak van de uterus. Voordat de vierkante golfpolsreeks wordt gestart, demonstreren we in het volgende videomicroscopieclip een volledige electroporatiecyclus in vivo. Electroporatie van de otische cyste van een muis op embryonale dag 11,5 vereist een voorzichtige plaatsing van de peddelvormige elektroden op de uterus.

In dit voorbeeld is de linker otische cyste gevuld met expressieplasmid en is de uterus vers geïrrigeerd met lactaat-Ringerselementen. De kathode is lateraal ten opzichte van de gevulde otische cyste geplaatst en de anode is mediaal geplaatst; aan het begin van de sequence bevindt de otische cyste zich in het centrum van het paddleveld. De uterus wordt voorzichtig gecomprimeerd en de vierkante golfpulsreeks wordt gestart met een voetpedalschakelaar.

Ideaal gezien wordt per puls een stroomsterkte van 60 tot honderd milliampère toegediend. De uterus wordt vervolgens losgelaten en onmiddellijk geïrrigeerd. De vers geïrrigeerde uterus wordt met zachte druk met de ringtang teruggebracht in de buikholte.

Zodra de uterus is geïnternaliseerd, wordt de buikholte gespoeld met ongeveer vier ml lactaat-Ringer; laat ongeveer één ml lactaat-Ringer in de buikholte achter om de hydratatie van de moederdier te ondersteunen, aangezien deze direct na een abdominale operatie minder water zal drinken dan gebruikelijk. De buikwand en vervolgens de huid worden gesloten met resorbeerbare hechtdraad met behulp van een naaldvoerder. Onze naaldvoerder heeft een ingebouwde schaar die het sluiten vereenvoudigt.

Wij geven de voorkeur aan een doorlopende hechting voor zowel de buikwand als de huid. We vergrendelen elke tweede steek om extra ondersteuning bij de incisieplaats te bieden. We dienen subcutaan een niet-steroïde ontstekingsremmend middel toe voordat we de moeder in de herstelkooi plaatsen.

Raadpleeg uw veterinaire staf over welke profylactische analgetica worden voorgeschreven door uw institutionele commissie voor dierenzorg en -gebruik. De moeder is ingebed in een steriel laken en wordt op de bodem van de verwarmde herstelkooi geplaatst. De herstelkooi bevat nestmateriaal, een rode buis als schuilplaats, laboratoriumvoer en een waterfles.

De kooi wordt de ochtend na de operatie weer in elkaar gezet met een filterkap aan de bovenzijde. Het moederdier is goed verzorgd, mobiel en in staat om op haar achterpoten te balanceren om de open bovenkant van de kooi te inspecteren. De hechting in de buik is schoon, droog en vertoont geen tekenen van openscheuren, roodheid of zwelling.

We hebben een document bijgevoegd waarin de ontwikkeling van het protocol voor dierenverzorging bij in utero gentransfer wordt besproken. Het document bevat formuleringen die nuttig kunnen zijn bij het ontwerpen van een instellingsspecifiek protocol in overleg met uw commissie voor dierenwelzijn en -gebruik. Deel vier, representatieve resultaten.

De representatieve resultaten in panelen A en B tonen een representatief slakkenhuis van een pup van zes dagen na de geboorte, waarvan de otis op embryonale dag 11,5 was geïnjecteerd met een expressieplasmid voor het enhanced green fluorescent protein en vervolgens was geëlektroporeerd. De laterale wand van het slakkenhuis is verwijderd van het middengedeelte en de apex. GFP-expressie is alleen aanwezig vanaf de basis tot het middengedeelte van het slakkenhuis en volgt de distributie van de haarcelmarker myosin seven A, zoals getoond in paneel B. Paneel C toont een confocale projectie bij lage vergroting van de embryonale dag.

18.5 muizen-organ van Corti immunogekleurd met een myosin seven A-antilichaam; getransfecteerde cellen zijn verspreid over het organ van Corti. Paneel D toont een confocale projectie bij hoge vergroting van het organ van Corti van een embryonale muis op dag 18.5, gekleurd met cin.Seven.

Een GFP-expressie wordt gedetecteerd in de binnenste en buitenste haarcellen, interphalangeale cellen, pijlercellen en TER-cellen. Elektroporatie-gemedieerde genoverdracht naar het otisch plakeuze weefsel op embryonale dag 11,5 transfecteert progenitorcellen die aan de basis liggen van alle componentceltypen binnen het Corti-orgaan.