Visualisatie van vasculaire Ca ^{2 +} Signalering Geactiveerd door Paracriene Derived ROS

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van vasculaire calciumsignalering die wordt getriggerd door pericrien afgeleide reactieve zuurstofsoorten of ROS. Dit wordt bereikt door eerst ROS te visualiseren met oxidatiesensitieve kleurstoffen in actieve macrofagen. ROS kunnen ook worden gevisualiseerd in endotheelcellen met behulp van plasmid-gebaseerde fluorescente sensoren.

Ga vervolgens over tot het gelijktijdig visualiseren van met cell tracker red gelabelde geactiveerde macrofagen en met flu of four gelabelde endotheelcellen in een co-kweekmodel. Meet tot slot de calciumsignalering in endotheelcellen die wordt getriggerd door macrofaag-afgeleide ROS, met behulp van een confocaal imagesysteem.

Deze resultaten kunnen ROS-niveaus onafhankelijk aantonen, evenals gelijktijdig de intracellulaire calciummobilisatie beoordelen die wordt getriggerd door Peregrine-afgeleide ROS. Deze methode maakt een gelijktijdige beoordeling mogelijk van twee verschillende signaleringsmoleculen die nauw betrokken zijn bij vasculaire signalering en een pathofysiologische simulator-setting. Twee postdocs in mijn laboratorium, Karthik en Raj, zullen de procedure demonstreren op basis van ruwe calciummetingen en interacties tussen macrofagen en endotheelcellen.

Kweek muismonocyten-afgeleide macrofagen op glazen bodem schaaltjes van 35 millimeter. Daag de cellen vervolgens uit met toll-like receptor-agonisten en incubeer deze gedurende zes uur bij 37 °C. Voor visualisatie van het cytosol.

Voeg een oxidatiesensitieve kleurstof voor ROS toe en incubeer de cellen gedurende 20 minuten. Visualiseer de cellen vervolgens op een temperatuurgecontroleerde tafel van een confocale imaging-opstelling. Om mitochondrial ROS in TLR-geactiveerde cellen te visualiseren, kan alternatief de mitochondriale superoxide-indicator worden toegevoegd, waarna de cellen 30 minuten worden geïncubeerd bij 37 °C.

Behandel de cellen voor een negatieve controle met PBS of voor een positieve controle met DMSO. Behandel de cellen voor een positieve controle met twee millimolar antimycine. Ga vervolgens over tot het visualiseren van alle cellen op de temperatuurgecontroleerde tafel van een confocale imaging-systeem.

Analyseer alle beeldata met behulp van Image J-software. De fluorescente sensor hyper detecteert zeer specifiek sub-micromolaire concentraties peroxide en, op basis van mammale expressie, kan het vectordesign worden gericht op respectievelijk het cytoplasma of de mitochondriën. Creëer via elektroporatie stabiele lijnen van pulmonale microvasculaire endotheelcellen van muizen die het passende hyper-expressieplasmid dragen.

Om de koloniegroei te vergemakkelijken, worden cellen op lage dichtheid geplaatst in compleet TMEM en gedurende 48 uur geïncubeerd; vervang vervolgens het medium door compleet kweekmedium aangevuld met een selectieantibioticum. Screen de klonen op het hoogste percentage hyperpositieve cellen en amplificeer de kweek om stabiele hyperpositieve lijnen te creëren voor individuele experimenten. Zaai cellen uit op met 0,2% gelatine gecoate dekglasjes en kweek deze gedurende de nacht tot 80% confluentie.

Activeer nu de cellen met TLR-liganden en incubeer deze gedurende zes uur bij 37 °C. Voor de detectie van cytoplasmatische ROS worden de dekglasjes met cellen gemonteerd in een adelo-celkamer. Voeg één milliliter voorverwarmde Hanks' balanced salt solution toe en plaats de kamer op een temperatuurgecontroleerde tafel van het confocale imagesysteem.

Registreer fluorescentiewijzigingen in cellen voor de detectie van mitochondriale ROS. Gebruik een positieve controle van twee micromolair antimycine A. Bereid vervolgens de dekglasplaatjes met behandelde cellen voor op confocale microscopie. Voer de beeldanalyse uit met ImageJ-software.

Begin met endotheliale cellen die zijn gegroeid tot 80% confluentie op met gelatine gecoate glazen dekglasjes voor de visualisatie en meting van intracellulaire calciumveranderingen. Incubeer de cellen in de fluorescerende kleurstof flu oh 4:00 AM bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was de cellen, om kleurstofverlies te minimaliseren, met experimentele imaging-oplossing die suen pyro zone bevat. Monteer nu de dekglasjes op een adelo cell chamber met 800 µL voorverwarmde experimentele imaging-oplossing en positioneer de cellen in een aparte buis op een temperatuurgecontroleerde tafel van het confocale imaging-systeem.

Gebruik 500 nanogram per milliliter cell tracker red C-M-T-P-X gedurende 15 minuten om de macrophagepopulatie die wordt onderzocht te labelen; was de cellen en resuspendeer de pellets in 200 microliter experimentele imaging-oplossing. Voeg nu de gelabelde macrofagen toe aan de met fluo-4 AM geladen endotheliale cellen in de confocale kamerassemblage; registreer de groene en rode fluorescentie elke drie seconden gedurende 10 minuten.

In dit experiment werden J 7 74 0.1-cellen gedurende zes uur blootgesteld aan TLR 2, 3 en 4-liganden. Representatieve confocale beelden tonen een toename van cytosolische ROS, gemeten met DCF. Interessant is dat MitoSOX-rode fluorescentie wijst op een soortgelijke toename van mitochondriale ROS.

Deze fluorescentieveranderingen zijn kwantitatief. De resultaten moeten daarom worden genormaliseerd en worden uitgedrukt als relatieve fold-verandering per behandeling; het antimycine A-signaal dient als positieve controle voor de productie van mitochondriale ROS. Deze figuur toont afbeeldingen van de peroxidegehaltes in het endotheel, het cytosol en de mitochondriën bij stabiele expressie van hyper cyto of hyper D mito.

MP ECS gestimuleerd met TLR-agonisten. Kwantificering van de gemiddelde fluorescentieverandering toont een toename van hyper cyto- en hyper D mito-fluorescentie aan na zes uur stimulatie in een co-cultuursysteem. Om Peregrine ROS-signalering te beoordelen, werden vers geïsoleerde mirin-macrofagen van zowel wild-type als GP 91 Fox-null muizen geactiveerd met 1 µg/mL LPS gedurende zes uur.

Macrofagen werden rood gelabeld met C-M-T-P-X en toegevoegd aan groen gefluoreerde MPM ecs. Interessant genoeg veroorzaakten LPS-geactiveerde macrofagen geïsoleerd uit wild-type muizen een grote en snelle calciummobilisatie in MPM ECS in vergelijking met macrofagen uit GP 91 Fox-null muizen.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat zowel langdurige belichting als laserblootstelling kan leiden tot auto-oxidatie van DCF. Het is cruciaal om fotobleken van hyper cyto en hyper D mitral te voorkomen. Zodra de techniek onder de knie is, kan de RA-meting in macrofagen en endotheelcellen in zeven uur worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd.