Metabole route Bevestiging en Discovery door ¹³ C-etikettering van proteïnogene aminozuren

Het doel van dit protocol is het bestuderen van het bacteriële metabolisme met behulp van metabole analyse ondersteund door koolstof 13. Om te beginnen worden microben gekweekt in de aanwezigheid van gelabelde koolstofsubstraten, die worden ingebouwd in de microbiële eiwitten. De microben worden vervolgens geoogst, waarna aminozuren worden geëxtraheerd, gehydrolyseerd en gederivatiseerd.

De monsters worden aangebracht op een gaschromatograaf en massaspectrometer of GC-MS. Door de atoomovergangspaden tussen metabolieten in het biochemische netwerk te volgen, kunnen de functionele metabolische routes die door de microbe worden gebruikt, worden bepaald. Ik ben Bert Burla.

De methode die we hier presenteren, kan worden gebruikt als aanvulling op transcriptomica en proteomics om de metabole routes in microben te bepalen. We hebben deze techniek gebruikt om fotosynthetische microben, zoals cyanobacteriën, te onderzoeken op myotroof of heterotroof koolstofgebruik. In deze video gebruiken we ANOTHE 5 1 1 42 als modelstam om het gebruik van gelabelde koolstofsubstraten voor het ontdekken van nieuwe enzymatische functies te demonstreren.

De procedure zal worden gedemonstreerd door mijzelf, li Yu en Chu Yang Fang. Begin deze procedure door cyana thesei-bacteriën te kweken in een niet-gelabeld medium. Wanneer de bacteriën de midden-logaritmische groeifase bereiken, inoculeert u 3% van het volume in het met koolstof 13 gelabelde medium.

Vervolgens moet worden voorkomen dat niet-gelabelde koolstof uit de initiële inoculum-subcultuur in hetzelfde gelabelde medium terechtkomt tijdens de middelste logaritmische groeifase. Wanneer de met koolstof 13 gelabelde Cy Thesei-bacteriën de middelste logaritmische groeifase bereiken, oogst dan 10 milliliters door middel van centrifugatie. Resuspendeer het pellet in 1,5 milliliters zes molar zoutzuur en breng dit over naar een helder glazen gaschromatografie- of GC-vial met schroefdop.

Sluit de flesjes af en plaats ze 24 uur lang in een oven van 100 °C om de biomassa-eiwitten te hydrolyseren tot aminozuren. Hydrolyse van biomassapellets levert 16 van de 20 veelvoorkomende aminozuren op; breng na de hydrolyse de aminozuuroplossing over naar microcentrifugebuisjes van 2 mL en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 20.000 ×g. Na de hydrolyse wordt de aminozuuroplossing overgebracht naar microcentrifugebuisjes van 2 mL en vervolgens 5 minuten gecentrifugeerd bij 20.000 ×g om vaste deeltjes neer te slaan.

Breng na het centrifugeren de supernatanten over naar nieuwe GC-vials om vaste deeltjes in de hydrolyse-oplossing te verwijderen, zodat deze de GC-kolom niet binnendringen. Vervolgens worden de aminozuren gedroogd om ze vluchtig te maken voor scheiding via gaschromatografie. Los de gedroogde monsters op met 150 µL tetrahydrofuran, THF en 150 µL N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamide.

Incubeer alle monsters in een oven tussen 65 en 80 °C gedurende één uur met acetamide, T-B-D-M-S derivatiseringsreagens. Vortex de monsters af en toe om er zeker van te zijn dat de metabolieten in het vial zijn opgelost. Centrifugeer de monsters op 20.000 ×g gedurende 10 minuten en breng vervolgens het supernatant over naar nieuwe GC-vials.

De supernatant moet een heldere, geelachtige oplossing zijn. De GC-temperaturen zijn als volgt: twee minuten vasthouden op 150 °C. Verwarmen met 3 °C per minuut tot 280 °C.

Verhoog de temperatuur met 20 °C per minuut tot 300 °C en houd deze vijf minuten vast. Stel vervolgens voor een GC-kolom van 30 meter de solventvertraging in op ongeveer vijf minuten en het bereik van de massa-ladingsverhouding tussen 60 en 500. Analyseer de monsters via GCMS met een splitverhouding van 1:5 of 1:10, een injectievolume van 1 µL en helium als dragergas met een debiet van 1,2 mL/min gedurende de run.

Analyseer de GCMS-gegevens met Microsoft Excel. De GC-retentietijd en de unieke massa-ladingsverhoudingspieken voor elk aminozuur zijn in deze figuur weergegeven. T-B-D-M-S-gederiveerde aminozuren worden meestal duidelijk door MS gesplitst in twee geladen fragmenten: fragment M minus 57, dat het volledige aminozuur bevat, en fragment M minus 159, waarbij de alfa-carboxylgroep van het aminozuur ontbreekt voor leucine en isoleucine.

De M minus 57 piek overlapte met andere massapieken van fragmenten. N minus 15 kan worden gebruikt om de volledige aminozuurlabeling te analyseren. Daarnaast wordt de F 3 0 2 groep vaak gedetecteerd in de meeste aminozuren, en deze bevat enkel de eerste alfa-carboxylgroep en de tweede koolstofatomen in een aminozuurbackbone.

Echter, omdat deze Ms.Peak vaak een hoge ruis-signaalverhouding heeft, wordt F 3 0 2 niet aanbevolen voor het kwantitatief analyseren van metabole fluxen. Derivatisering van aminozuren of centrale metabolieten introduceert aanzienlijke hoeveelheden natuurlijk gelabelde isotopen, waaronder koolstof 13, zuurstof 18, silicium 29 en silicium 30. De meetruis van natuurlijke isotopen in het ruwe massa-isotoop of spectrum kan worden gecorrigeerd met behulp van gepubliceerde software.

De uiteindelijke isotopische labelingsgegevens worden gerapporteerd als massafracties. Bijvoorbeeld, M nul, M1, M twee, M drie en M vier, die fragmenten vertegenwoordigen die nul tot vier koolstof-13 gelabelde koolstoffen bevatten. Deze 5 1 1 2 bevat niet het enzym threonine ammonia-lyase, dat de omzetting van threonine naar 2-ketobutyraat katalyseert in de typische isle-syntheseroute.

Daarom werd, om de isoleucine-route in dit organisme te ontrafelen, cyana THESEI 5 1 1 42 gekweekt in ASP twee medium met 54 millimolar glycerol en geanalyseerd via GCMS zoals beschreven in deze video zoals hier getoond; Cyana Thesei 5 1 1 4 2 gebruikt glycerol met een label op de tweede positie als belangrijkste koolstofbron, en we observeerden dat threonine en alanine, waarvan pyruvaat de precursor is, één gelabeld koolstofatoom hebben, terwijl isoleucine gelabeld was met drie koolstofatomen. Daarom kan de synthese in cyana, these 5 1 1 4 2 niet afkomstig zijn uit de threonine-route die door de meeste organismen wordt gebruikt. Aan de andere kant hebben leucine en isoleucine identieke labelingspatronen op basis van fragment M minus 15 en fragment M minus 1 59.

Bijvoorbeeld, de isotoop of gegevens van N minus 15 met ONGEFRAGMENTEERDE aminozuren vertoonden een identieke markering voor leucine en ISO leucine. Bijgevolg moeten leucine en ISO leucine worden gesynthetiseerd uit dezelfde precursoren, pyruvaat en acetyl-CoA. Deze waarneming is consistent met de gemarkeerde koolstoftransitie in de Citra malaat-route voor isle-synthese.

Deze methode kan worden gebruikt om het metabolisme van een grote verscheidenheid aan microben te onderzoeken en kan, eenmaal beheerst, in ongeveer één week van begin tot eind worden uitgevoerd.