Toepassing van MassSQUIRM voor kwantitatieve metingen van Lysine demethylase activiteit

Het mass squirm-protocol is bedoeld om de lysine-demethylase-activiteit te kwantificeren met behulp van isotopische methylering en MALDI-massaspectrometrie. Voer eerst enzymgekatalyseerde demethyleringsreacties uit op peptiden die gemethyleerde lysine bevatten. Methylleer vervolgens de peptideproducten van de demethylasereactie chemisch met gedeutereerd formaldehyd om uniform gemethyleerde peptiden te produceren die op dezelfde wijze ioniseren via MALDI. Kwantificeer vervolgens elke peptidesoort met MALDI-massaspectrometrie en houd rekening met isotopische overlap. Om de relatieve hoeveelheden on-, mono-, di- en trimethyl-peptiden te identificeren, bepalen de mass squirm-resultaten de relatieve hoeveelheden van elk demethylasereactieproduct op basis van massaveranderingen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals routinematige massaspectrometrie, is dat de massascore rekening houdt met verschillen in ionisatie tussen verschillend gemethyleerde peptiden. We kregen voor het eerst het idee voor deze aanpak toen we een methode ontwikkelden om histonacetyleringsniveaus te meten met behulp van isotopisch zwaar azijnzuuranhydride. De uitdaging bij deze techniek is het extraheren van gegevens over de piekruimte, wat bemoeilijkt kan worden door overlap van isotopische enveloppen van peptiden.

Combineer voor de demethylasereactie 125 nanogram recombinant lysine-specifiek demethylase één-enzym met 0,25 microgram gebiotineerd dimethyl histone H3-peptide in een eindvolume van 20 microliter demethylasebuffer. Bereid daarnaast een controlemonster voor met 0,25 microgram peptide zonder het LSD1-enzym; incubeer de reactie- en controlebuisjes gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Meng voor de bereiding van R2 20 micron poreuze beads gelijke volumes beads en methanol.

Voeg vervolgens 10 volumes TFA-mierenzuur toe, voeg acht microliter poreuze beads toe aan elk monster en agiteer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Conditioneer ondertussen twee C 18 zip tips. Pipetteer tweemaal met 20 microliter 0,1% TFA, vier keer met 70% acetonitril 0,1% TFA en nogmaals vier keer met 0,1% TFA.

Laad vervolgens de twee monsters op de geconditioneerde zip tips. Duw met een pipetteur het volume door de C 18 hars. Herhaal dit totdat het totale volume van beide monsters door de zip tips is geduwd.

Was vervolgens de zip tips tweemaal met 20 µL 0,1% TFA en elueer de monsters in 40 µL elutiebuffer; laat deze vervolgens volledig drogen met een speed vac-concentrator. Resuspendeer het monster eerst in 100 µL 50 mM fosfaatbuffer pH 7,4. Voeg daarna acht µL borat-dimethylamine en 16 µL gedestilleerd formaldehyde toe.

Incubeer gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Herhaal de reductieve methylering door boring dimethylamine en gedeutereerd formaldehyd toe te voegen en incubeer gedurende twee uur. Voeg de derde keer boring dimethylamine toe en incubeer gedurende 15 uur bij vier graden Celsius.

Stop de reactie met 12,5 µL 1 M tris pH 7,4 en droog het mengsel volledig met een speed vac concentrator. Suspendeer vervolgens de controle- en demethylase-reactiemonsters in 100 µL 50 mM fosfaatbuffer pH 7,4.

Voeg nu acht µL poreuze kraaltjes toe aan de controle- en demethylase-reactie monsters en verzamel deze op zip tips zoals eerder beschreven. Elueer in volumes van twee µL op een MALDI-monsterplaat en laat dit bij kamertemperatuur drogen tot kristallisatie. Ga verder met het analyseren van de monsters via massaspectrometrie.

Open de spectrovbestanden in de bijbehorende software en exporteer deze naar de M over Z-software. Verifieer de reactieproducten vervolgens via tandem-massaspectrometrie. Bepaal eerst de verhouding van het piekoppervlak van de koolstof 13 C twee- en koolstof 13 C vier-isotopen ten opzichte van de mono-isotopische piek voor de controlemonsters.

Gebruik deze berekende ratio's om de relatieve hoeveelheid peptide in elke modificatie te kwantificeren. Toestand van het demethylasereactiemonster. Het LSD1-enzym kan effectief worden gebruikt voor massaspectrometrische kwantificering van lysinedemethylering.

Aangezien de contralereactie geen reductieve methylering ondergaat, geeft deze de typische isotopische envelop voor dit peptide aan. De resulterende piekoppervlakken bepalen de achtergrondverhoudingen van het peptide dat voorkomt in koolstof 13 C twee en koolstof 13 C vier. Isotopische toestanden en piekoppervlakken uit het massespectrum voor de contralereactie maken kwantificering mogelijk van de relatieve hoeveelheid peptide in elke modificatietoestand. In de demethylasereactie bepalen de piekoppervlakken van deze controle- en demethylasereacties 33,7% dimethyllysine 4, 42,0,3% monomethyllysine vier en 24% ongemethyleerde lysine vier.

Deze massasquame-benadering biedt cruciale inzichten in het veld van de histone-epigenetica, zoals de manier waarop demethylering van histonlysineresiduen bijdraagt aan diverse ziekten. Hoewel deze methyleringsanalyse is toegepast om demethylasen te bestuderen, kan deze ook worden gebruikt voor het bestuderen van methyltransferasen.