Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons

Het algemene doel van het volgende experiment is om de snelheden van DNA-herstel en celkernextracten in real-time te meten met behulp van moleculaire bakens die fluoresceren zodra ze zijn hersteld. Moleculaire bakens voor basische excisieherstel bestaan uit deoxy-oligonucleotiden in een stam-lusstructuur die een enkele basislaesie bevat, met zes curve oxy fluoresceïne-eenheden geconjugeerd aan de 5'-uiteinden en dil-eenheden geconjugeerd aan de 3'-uiteinden wanneer deze zijn gevouwen. De six fam-eenheid wordt op een niet-fluorescerende wijze gedoofd door dab sil via Förster-resonantie-energietransfer.

Om de DNA-reparatieactiviteit te beoordelen, worden beacons geïncubeerd met nucleaire celextracten die reparatie-enzymen bevatten. DNA-glycosylase herkent en verwijdert de DNA-laesie in de beacon. De resulterende ABA-sites zijn substraten voor AP-endonucleasené een of ape één. Na herkenning splitst APE één de DNA-backbone bij de ABA-site, waardoor het DNA dat de six fam bevat vrij kan dissociëren van de hairpin.

Loskoppeling van de quencher resulteert in een toename van de fluorescentie die proportioneel is aan het niveau van DNA-herstel en in real-time kan worden beoordeeld met behulp van een kwantitatieve real-time PCR-machine. Het vermogen om DNA-schade te herstellen is cruciaal voor elke cel en elk organisme. Van de talrijke cellulaire DNA-herstelpaden richt base excision repair zich op beschadigde basen die kunnen voortkomen uit oxidatieve of chemische aantastingen; het verduidelijken van de rol van individuele cellulaire elementen die base excision repair kunnen beïnvloeden, is een van de hoofddoelstellingen van onze laboratoriumstudies.

Daarom is het nauwkeurig en gevoelig meten van de DNA-reparatieactiviteit een interessepunt geworden in ons laboratorium. Deze assay kan dergelijke gegevens verschaffen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals 32 PN-labeling en analyse via gelelektroforese, is dat onze techniek geen radioactief gelabelde substraten gebruikt, DNA-reparatiesnelheden in real-time kan meten en een zeer groot dynamisch bereik heeft.

Verder kan deze aanpak gebruikmaken van verschillende fluoroforen en/of basisschade om de substraatspecificiteit te bepalen. Wij hebben aangetoond dat deze assay zeer kwantitatief en zeer gevoelig is in verschillende omgevingen. Deze moleculaire beacon-assay voor base-excisieherstel is geschikt voor kinetische analyse.

De hoge sensitiviteit en specificiteit van de assay maken een nauwkeurige kwantificering van base-excisie-reparatie mogelijk, waardoor deze nuttig is voor screenings van reparatieremmers of voor validatie. Bovendien is de methode aanpasbaar voor het meten van de reparatieactiviteit in weefsels en tumorcellysaten voor functionele biomarkermetingen. Houd bij het ontwerpen van moleculaire beacons voor deze assay rekening met de volgende DNA-oligonucleotiden van 43 basen lang, zoals hier getoond.

Werk goed. De DNA-sequentie is niet uniek, maar moet de vorming van een haarspeldstructuur mogelijk maken. Wanneer deze geknikt is zoals hier getoond, wordt specificiteit bereikt door de insertie van specifieke baseletsels zoals uracil of tetrahydrofuraan.

Op positie X, zes basen vanaf het vijf-prime uiteinde, moet het GC-gehalte ten minste 32% bedragen en er mag geen GB-base op het vijf-prime uiteinde worden geplaatst. Zes carboxyfluoresceïne of zes fam moet worden geconjugeerd aan het vijf-prime uiteinde en het drie-prime uiteinde moet worden gemodificeerd met dab sil. Dit zal het substraat vormen voor de DNA-reparatie-eiwitten om de binding en activiteit van de glycosyl-releases te waarborgen.

De positie van de letsel is gekozen om voldoende ruimte te laten tussen de haarspeldstructuur en het uiteinde van het DNA. De lengte van de stam of de haarspeld-duplex moet minimaal 15 basenparen bedragen. De aanbevolen luslengte is 13 basen.

De controle-molecular beacon moet identiek zijn aan de experimentele molecular beacon, behalve dat deze geen DNA-laesie bevat. Daarom mag deze niet worden herkend door DNA-reparatie-enzymen. Zodra de molecular beacons beschikbaar zijn, moet een kwaliteitsbeoordeling worden uitgevoerd om er zeker van te zijn dat de beacons niet fluoresceren totdat ze worden verhit.

En om de optimale smelttemperatuur te bepalen, moeten alle stappen tijdens de extractieprocedure op ijs of bij vier graden Celsius worden uitgevoerd. Om de eiwitstabiliteit te waarborgen, dient men zich voor te bereiden op het experiment door vooraf te koelen. Twee bekerglazen van één liter per monster, dialysebuffer, dialysekamers, microcentrifugebuisjes, spuiten en naalden.

Label 15 milliliter conische buizen en plaats deze op ijs. Aspireer het groeimedium van de cellen en was ze vervolgens twee keer met 7,5 milliliter koud PBS. Voeg na de tweede wasbeurt vijf milliliter koud PBS toe aan elke schaal en gebruik een cell lifter om de cellen van de plaat te schrapen.

Breng de cellen over naar een gekoelde conische buis van 15 milliliter en centrifugeer vervolgens bij 500 ×g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en schat het gepakte celvolume door dit te vergelijken met bekende vloeistofvolumes in vergelijkbare buizen. Centrifugeer de buizen nog een minuut en verwijder vervolgens de resterende PBS met een pipet.

Resuspendeer de celpellet in 150 µL nuke buster extractiereagens één voor elke 50 µL gepakt celvolume. Draag de geresuspendeerde cellen vervolgens over naar een vooraf gekoelde 1,5 mL buis en vortex deze 15 seconden op hoge snelheid. Incubeer de buis na het vortexen vijf minuten op ijs, vortex vervolgens nogmaals 15 seconden en centrifugeer 5 minuten bij 13.000 ×g bij 4 °C.

Verwijder na het centrifugeren de supernatant, die de cytoplasmatische fractie bevat, en gooi deze weg. Resuspendeer de pellet in een mengsel van 1 µL resuspendeerde 100 x protease-remmercocktail, 1 µL 100 mM DTT en 75 µL Nuke Buster extractiereagens twee per 50 µL gepakte celvolume.

Vortex de cellen 15 seconden op hoge snelheid. Incubeer vijf minuten op ijs en vortex opnieuw 15 seconden op hoge snelheid; centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 13.000 ×g bij 4 °C. Gebruik na de centrifugatie een spuit om het supernatant, dat de kernproteïnen bevat, over te brengen naar een slide-dialyse cassette met een molecular weight cutoff van 7.000.

Voeg vervolgens 500 µL van 1 M DTT toe aan 500 mL voorkoelde dialysebuffer en dialyseer het lysaat gedurende 90 minuten bij 4 °C onder voorzichtig roeren. Breng de dialysecassette na 90 minuten over naar een tweede bekerglas met 0,5 L voorkoelde dialysebuffer met DTT en dialyseer het lysaat gedurende 90 minuten bij 4 °C onder voorzichtig roeren. Na de dialyse kan het extract zijn gekristalliseerd als gevolg van hoge proteïneconcentraties.

Plaats vervolgens een nieuwe spuit in een andere poort dan degene die is gebruikt om de cassette te injecteren en verzamel de gedialyseerde nucleaire eiwitoplossing uit de dialysecassette. Probeer troebel uitziende kristallen mee te nemen bij het verwijderen van de gedialyseerde nucleaire eiwitoplossing. Verdeel het monster in aliquoten van 20 µL in microcentrifugebuisjes, vries deze snel in op droogijs en bewaar ze vervolgens bij -80 °C tot gebruik.

Bepaal de proteïneconcentratie en voer de kwaliteitscontrole uit zoals beschreven in het bijbehorende document. Om de molecular beacon-assay uit te voeren, worden de cellysaten ontdooid en verdund tot 2 µg per µL proteïne met basis excision repair reactiebuffer die 1 mM DTT bevat; verdun de molecular beacons tot 200 µM met basis excision repair reactiebuffer. Aangezien de quantitative real-time PCR-machine doorgaans niet als fluorimeter wordt gebruikt, dient de run-methode op de quantitative real-time PCR-machine te worden gewijzigd om elke 20 seconden gegevens te verzamelen bij 37 °C gedurende ten minste 180 cycli.

Vervolgens elke 20 seconden gedurende 15 cycli bij de maximale fluorescentie van de molecular beacon om gegevens voor normalisatie te verkrijgen. Stel het reactievolume in op 25 µL. Stel daarna het plaatontwerp op het instrument in met behulp van de software van Applied Biosystems, waarbij de standaardcurve als experimenttype is geselecteerd, en voltooi de plaatlay-out.

Een voorbeeld wordt getoond in deze tabel, die ook te vinden is in het bijbehorende document. Voeg niets toe aan de well die is geselecteerd als de standaardcurve. Plaats de basisexcisie-reparatiereactiebuffer, DTT, het cellysaat bij een concentratie van 2 µg/µL en alle moleculaire beacons die in het experiment worden gebruikt op ijs.

Voeg vervolgens DTT toe aan de basis-excisieherstel-reactiebuffer tot een eindconcentratie van 1 mM. Pipetteer 15 µL van de basis-excisieherstel-reactiebuffer met DTT in elke put van een geschikte optische qPCR-plaat op ijs. Pipetteer daarna, volgens het plaatoverzicht, de beacons in de juiste putten.

Elke combinatie van lysaat en molecular beacon of controle moet in drievoud worden geanalyseerd. Pipetteer tot slot vijf µL van het verdunde nucleaire lysaat per putje in de juiste putjes. Het is belangrijk om alle molecular beacon-reagentia koud te bewaren en de lysaten als laatste stap in de plaat te pipetteren.

Onthoud dat de lysaten actieve eiwitten bevatten en dat deze direct met het herstellen van de moleculaire beacons zullen beginnen zodra ze in het reactiemengsel worden gepipetteerd. Daarom is het zeer belangrijk om alle reagentia koud te houden om de mate van beacon-herstel te minimaliseren voordat u begint met het uitvoeren van de metingen. Zodra alles is toegevoegd, verzegelt u de plaat met optische kleefilm en mengt u de inhoud door voorzichtig op de plaat te tikken.

Voer vervolgens een korte centrifugeerstap van tien seconden uit om de oplossingen onderin de buisjes of plaat te verzamelen. Plaats na het centrifugeren de plaat in het quantitative realtime PCR-apparaat en start de assay. Exporteer na voltooiing de ruwe data bij voorkeur in Excel-formaat en volg de instructies in het bijbehorende document om de gegevens te analyseren zodra de benodigde berekeningen zijn uitgevoerd. Zet de genormaliseerde fluorescentiegegevens uit als percentage vrij fam tegenover de tijd in seconden in een scatterplot met de bijbehorende foutenbalken om de DNA-reparatieactiviteit en de kwaliteit van de nucleaire extracten van de LN 4 28-cellen en een MPG-overexpressie-cellijn, aangeduid als LN 4 28 MPG, te beoordelen. De in deze video beschreven assay werd uitgevoerd met gebruik van een molecular beacon die het APE one-substraat tetra furine bevat als positieve controle.

Zoals in deze figuur wordt getoond, hebben beide cellijnen een robuuste APE1-activiteit, wat wordt aangegeven door de steile helling, en een DNA-glycosylase-activiteit die specifiek is voor de verwijdering van het MPG-substraat. Hypoxanthine, aangeduid als HX, werd gemeten in nucleaire lysaten van beide cellijnen. Elk lysaat werd geanalyseerd met gebruik van ofwel een base excision repair-controle-molecular beacon, ofwel een base excision repair HX-molecular beacon; voor de controle-beacon wordt LN 4 28 in het groen getoond en LN 4 28 MPG in het paars voor de hypo-beacon.

LN 4 28 is in het blauw weergegeven en LN 4 28 MPG is in het oranje weergegeven. De resultaten worden gerapporteerd als A de gemiddelde fluorescentie-eenheden en B de genormaliseerde fluorescentie. In elke cel trad een tijdsafhankelijke toename van de fluorescentie op, wat duidt op HX-herstel.

Het lysaat werd zoals verwacht geïncubeerd met de HX-molecular beacon. De LN 4 28 MPG-cellijn, aangegeven door de oranje curve, vertoonde een veel hogere herstelsnelheid, wat blijkt uit de snellere toename van de fluorescentie dan bij de ouderlijke LN 4 28-cellijn, die minimaal MPG-eiwit bevat. De herstelsnelheid van specifieke DNA-laesies door specifieke hersteleiwitten kan dus in real-time worden gemeten vanuit celextracten, met minimale achtergrondniveaus van aspecifieke DNA-splitsing.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uw molecular beacons ontwerpt en realtime DNA-reparatiesnelheden meet met behulp van ofwel gezuiverde eiwitten of cellysaten. Met betrekking tot de analyse is het essentieel om het dynamische bereik en de achtergrondwaarden te beoordelen; doe dit door het opnemen van controle-reacties, zoals met of zonder de positieve en negatieve controle-beacons. Gezien de variabiliteit tussen de wells is het nuttig om de gegevens in de individuele wells te normaliseren ten opzichte van de inputwaarden.

Deze worden bepaald door de fijnere stap bij de smelttemperatuur. Dit en de toevoeging van andere kleurstoffen, zoals een referentiekleurstof, zullen rekening houden met de variabiliteit die inherent is aan pipetteerfouten of verschillen in detectoren. Deze techniek stelde ons in staat om de invloed van individuele componenten van base-excisie-reparatie op de totale reparatieactiviteit en -capaciteit te verduidelijken.

Het is gevoelig genoeg om kleine veranderingen te onthullen die met conventionele methoden niet detecteerbaar zouden zijn geweest.