Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow

In deze procedure tonen we een kwantitatieve intravitale microscopiebenadering om de dynamiek van de passage van parasieten door de milt te beoordelen. In een knagermalariamodel worden muizen die geïnfecteerd zijn met GFP-transgene parasieten voorbereid voor intravitale microscopie van de milt; canulatie van de miltader maakt de injectie van intravitale kleurstoffen mogelijk. Tijdens het experiment worden fluorescente cellen afgebeeld terwijl ze door verschillende gebieden van de milt bewegen.

Wij bieden de methodologie om de mobiliteit van parasieten in het driedimensionale trage compartiment van de rode pulpa te beschrijven en de bloedstroom in de vaten te berekenen. Deze parameters werden gebruikt om de miltendynamiek van twee PULE-stammen te vergelijken. Hallo iedereen.

Mijn naam is Nando El Portillo en een van de belangrijkste onderzoeksvragen in mijn laboratorium is het begrijpen van de rol van de milt bij malaria. Splenomegalie is een van de kenmerken van deze ziekte, maar vanwege technische en ethische kwesties is het zeer moeilijk om studies naar dit orgaan uit te voeren. Om dit mogelijk te maken, hebben we technologieën ingezet die ons in staat stellen de dynamische passage van deze parasiet te observeren en dit fenomeen te kwantificeren.

Dit is wat Lorena en MI in deze protocollen zullen uitleggen. Dit onderzoek wordt gedeeltelijk uitgevoerd in samenwerking met de groepen van Dr. Ler van de Universiteit van Hamburg in Duitsland en Dr. Maria Kbo hier bij het Hospital Clinic en is algemeen gefinancierd door fund fion Cellex en ministerieel CIA In Espanol. De infectie wordt gestart bij Donor M, geïnfecteerd met GFP-parasieten (lethaal of niet-lethaal) bij een parasitemie van 10%. Om de parasieten te controleren, neemt u een kleine druppel bloed uit de staartvin van de muis en brengt u deze aan op een microscoopglas.

Maak een dikke druppel kleuring met GIMs. Een oplossing maakt geïnfecteerde rode bloedcellen zichtbaar na het drogen; fixeer het bloedsmeer gedurende twee minuten met methanol, breng de GIMs-oplossing aan en incubeer 20 minuten. Was de plaat met stromend kraanwater en droog deze. Tel het percentage pbc's ten opzichte van het totaal aantal RBC's met behulp van een lichtmicroscoop met een 100x olie-objectief.

Infecteer muizen met lethale of niet-lethale parasieten, verkregen uit het staartbloed van donormuizen en verdund in PBS. Stel de dosis zo in dat er een halve miljoen parasieten per muis wordt geïnjecteerd om op dag drie na infectie een perifere parasitemie van 1% te bereiken; injecteer intraperitoneaal. Alternatief kunnen FITC-gelabelde RBC's in de controle worden gebruikt.

Verzamel één milliliter arterieel bloed van een muis en was de pellet door centrifugatie in PBS met EDTA, resuspendeer in FITC-oplossing en incubeer gedurende twee uur in het donker onder zachte agitatie. Verwijder na die tijd het supernatant door centrifugatie en was uitgebreid. Injecteer in een controlemuis om een gemiddelde van 1% in de perifere circulatie te bereiken en ga over tot de in vivo-experimenten.

Hallo, ik ben mija. Om de milt in vivo te visualiseren, moeten we een kleine chirurgische ingreep bij het dier uitvoeren om de milt bloot te leggen; deze techniek heb ik geleerd van Stephanie GR in het laboratorium van worker Heisler, die ik graag wil bedanken, en nu zal ik u laten zien hoe u te werk moet gaan.

Beeldvorming van geïnfecteerd myosis uitgevoerd op dag drie na infectie wanneer parat 1% is in beide stammen. Houd de muis gedurende de gehele procedure onder narcose en bij een gereguleerde temperatuur. Bescherm de ogen tegen hydratatie en verifieer dat de muis volledig is geanestheseerd door op het voetkussentje te tikken voordat u verder gaat, om de intraveneuze toediening van stoffen te vergemakkelijken.

Cannuleer tijdens het verloop van het experiment de staartvene van de muis om de canule aan te leggen. Steek een kleine naald in het ene uiteinde van een buisje en de applicator in het andere uiteinde. Vul de canule met fysiologische zoutoplossing onder verwijdering van luchtbellen en controleer of de oplossing correct door de canule stroomt.

De laterale staartvena wordt gecannuleerd. Verbeter de zichtbaarheid door een lichte constrictie aan de basis van de staart aan te brengen. Voer de punt van de canule in de ader in.

Het verschijnen van bloed geeft aan dat de naald correct is geplaatst. Is dit niet het geval, herhaal de canulatie dan stroomopwaarts van de ader en fixeer vervolgens de canule met lijm en tape aan de staart. Leg het onderste deel van de milt vrij via een kleine incisie in de huid en musculatuur aan de linker dorsale zijde van het dier.

Plaats een milt op een plek waar weinig ademhalingsbeweging waarneembaar is en breng PBS aan op het blootgestelde oppervlak om het vrij te houden van muizenhaar en gehydrateerd te houden. Seal de milt af met een dekglas om visualisatie mogelijk te maken. Hallo, mijn naam is Lorena.

Het getoonde protocol stelt ons in staat om de beweging van PULI-parasieten door de milt te visualiseren. Dit is mogelijk gemaakt dankzij GFP-transgene parasieten. Vriendelijk geschonken door James Burnes van Drexel University.

Het in beeld brengen van de beweging van fluorescerende parasieten zal ons laten weten of er verschillen zijn in het gedrag tussen letale en niet-letale stammen. De microscopie-experimenten werden uitgevoerd in een Leica multiphotonmicroscoop, uitgerust met een incubatiesysteem met temperatuurregeling en een 63 x glycerine-objectief. Plaats het dier op de tafel van de microscoop met een dekglas, waarbij de milt naar beneden is gericht naar het objectief. Aanvankelijk.

Visualisatie van de milt bij lagere vergrotingen geeft een algemeen overzicht van de microcirculatoire structuur van het orgaan. Focus op de milt met behulp van autofluorescerend weefsel; GFP-parasieten zijn zichtbaar terwijl ze door de verschillende gebieden van de milt trekken. Hallo, mijn naam is Maria Albo van de Scientific and Technological Centers van de Universiteit van Barcelona, en we gaan intravitale beeldvorming van de milt uitvoeren.

Om de bloedstroom en mobiliteit van geïnfecteerde rode bloedcellen te bestuderen, maken we gebruik van een confocale microscoop uitgerust met een resonante scan, die snelle beeldvorming mogelijk maakt en zeer nuttig is om de beweging van het orgaan te compenseren. Dit is een spectrale microscoop waarmee het waarnemingsbereik kan worden geselecteerd. Om zeer snel beelden vast te leggen, voeren we een simultane acquisitie uit van de twee fluoresceïne-markeringen en de reflectie.

Selecteer verschillende zones om te beeldvormen met behulp van RBC, reflectie, contrast en Vidal-kleurstoffen om de microvasculatuur van de milt in beeld te brengen. We zullen nu uitleggen hoe de mobiliteit van parasieten in de bloedstroom van vaten kan worden gemeten met Vidal-microscopie en ImageJ-software om de beweging van parasieten in het driedimensionale netwerk van de rode pulpa te volgen. Neem beelden op over vijf Z-dieptes met behulp van een high-speed scanning-modus.

Zet beeldstacks om in Z-gecodeerde kleurenfilms om het volgen van een enkele fluorescente cel te vergemakkelijken. Gedetailleerde informatie wordt verstrekt in de tekst om verschillende deeltjes over tijd en diepte in elke video te volgen met behulp van X-, Y-, Z- en T-coördinaten; mobiliteitsparameters zoals directionaliteit, gemiddelde snelheid en verblijftijd kunnen worden berekend en worden weergegeven als distributiekaarten om comparatieve analyse tussen stampopulaties mogelijk te maken. Vasculaire flow in de milt kan worden gebeeld door systemische injectie van verschillende fluorescente moleculen, zoals dextrine, beschreven in de ondersteunende tabel.

En scan, met behulp van endogene erytrocyt-reflectiecontrast, de bloedstroom langs de middellijn door de vaten horizontaal in de richting van de laserscan te plaatsen en een verbeterde lijnmiddeling toe te passen. In deze beelden zullen de strepen die ontstaan door bewegende cellen worden gebruikt om de bloedstroom te berekenen; neem beelden op van vaten met verschillende diameters en gedurende de hartcyclus om voor fluctuaties te compenseren. De milt werd lange tijd beschouwd als een black box in malariaonderzoek en we hebben hier een kwantitatieve intravitale microscopiebenadering ontwikkeld om inzicht te krijgen in de dynamiek van parasitinfectie en bloedstroom in dit orgaan, waardoor we belangrijke biologische vragen kunnen beantwoorden, zoals de in vivo adhesie van geïnfecteerde rode bloedcellen aan de milt.

Dank u wel en.