Het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens Progressieve kolonisatie van Kiemvrije Mouse door ¹ H NMR-spectroscopie

Het doel van deze procedure is om de impact van een progressieve kolonisatie op het hepatische metabolisme van de gastheer te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst kiemvrije muizen progressief te koloniseren. Het kolonisatieproces wordt gemonitord door de urinaire uitscheiding van microbiële co-metabolieten te evalueren via NMR-spectroscopie.

Na het monitoren van het kolonisatieproces wordt er een leverbiopt van de muis afgenomen en voorbereid voor metabolische profilering. Het hepatische metabole profiel kan vervolgens worden verkregen uit het intacte biopt met behulp van niet-destructieve high-resolution magic angle spinning NMR-spectroscopie. Uiteindelijk onthult dit gebruik van proton-NMR-spectroscopie diverse metabolieten die betrokken zijn bij metabole routes, zoals energie- en oxidatieve stressroutes.

Zo kan dit experiment inzicht bieden in de leverfuncties tijdens kolonisatie. Het kan ook worden toegepast op systemen zoals de nieren. Om de dieren te koloniseren, worden kiemvrije muizen uit de isolatoren gehaald en gehuisvest in een conventionele opstalgruimte in kooien, voorzien van een filter vóór de conventionele dieren die als controles dienen.

Meng vervolgens de helft van de drie dagen oude strooisel uit de conventionele controlekooi met het strooisel van de kiemvrije dieren. Verzamel urine in een microbuisje van 1,5 milliliter door de muis boven het buisje te houden en de mictie te bevorderen door voorzichtig de blaas te masseren. Voor acquisitie met een vijf millimeter NMR-probe is een minimum van 20 µL vereist, maar het wordt aanbevolen om 30 µL te gebruiken om de kwaliteit van de metabole profilering te verbeteren. Bevries de urine onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar deze bij minimaal -40 °C tot aan de NMR-analyse.

Bereid vóór de NMR-acquisitie een 0,2 molaire natriumfosfaatbuffersolution in zwaar water voor. pH 7,4 bevatten een millimolaire TSP mix; meng 30 microliters van de urine met 30 microliters natriumfosfaatbuffer. Breng 50 microliters van de gemengde oplossing over naar een 1,7 millimeter NMR-capillairbuis met behulp van een 50 microliter glazen spuit uitgerust met een metalen naald.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Plaats de capillaire adapter bovenop de capillair met de urine-monster en zet deze in een 2,5 millimeter NMR-microbuis voor een vijf millimeter NMR-probe. Deze combinatie van buizen kan worden gebruikt als een standaard vijf millimeter NMR-buis voor spectrale acquisitie.

In deze demonstratie wordt een Bruker Avance III 700 megahertz NMR-spectrometer gebruikt voor het verzamelen van de gegevens. Neem eendimensionale proton-NMR-spectra op met de parameters die in het schriftelijke protocol worden besproken. Gebruik na de NMR-acquisitie de extractiestang om de capillair uit de 2,5 millimeter NMR-buis te verwijderen door de capillairadapter voorzichtig aan te draaien om deze eruit te trekken, nadat de dieren zijn geëuthanaseerd zoals beschreven in het schriftelijke protocol.

Bereid de leverbiopsie voor. Gebruik geen producten die alcohol bevatten om contaminatie te voorkomen en reinig de instrumenten met water of een zoutoplossing. Neem leverbiopten uit de linkerlob voor reproduceerbare resultaten.

Verzamel weefsel consistent in het centrum van de linkerlob, waarbij de perifere gebieden waar het weefsel dunner is, worden vermeden. Zorg ervoor dat de galblaas niet wordt geperforeerd om gallekkage te voorkomen. Was het weefsel onmiddellijk met water of een zoutoplossing.

Vries biopsieën onmiddellijk snel in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij minus 80 degrees Celsius tot de NMR-analyse. Om de H-R-M-A-S-N-M-R op te stellen, plaatst u de derde biopsie in een zirkoniumrotor en vult u het resterende volume met puur zwaar water voor de NMR-lock. Pas op dat er geen luchtbellen ontstaan, omdat deze de kwaliteit van de daaropvolgende shimming en data-acquisitie kunnen beïnvloeden. Plaats een 50 µL Teflon-spacer met behulp van de cilindrische schroef.

Draai het los en kalibreer het met de dieptemeter op de korte zijde. Plaats de schroefpen op de afstandhouder en draai deze voorzichtig vast met de schroevendraaier. Droog het behuis en eventueel resterend water af met een stukje keukenpapier.

Plaats vervolgens de dop bovenop de rotor en voeg deze toe aan de rotorpakker. Druk stevig aan tot de dop goed vastzit. Er mag geen ruimte overblijven tussen de rotor en de dop. Markeer de helft van de onderkant van de rotor met een zwarte markeerstift om optische detectie van de spinsnelheid mogelijk te maken.

Zodra de rotor voldoende is gepakt, plaatst u deze in de NMR-spectrometer en start u het opspinnen naar vijf kilohertz. Hier is een Bruker Avance III 500 megahertz spectrometer gebruikt. Neem het protonen-NMR-spectrum op met behulp van een CPMG-pulssequentie.

Volgens de richtlijnen van de fabrikant kan de overvloedige alfa- en numerieke glucose-dubbelpiek bij 5,22 parts per million worden gebruikt om de resulterende NMR-spectra te kalibreren. Om de rotor uit te pakken, verwijdert u de dop met de dopverwijderaar, draait u de schroefpen los en verwijdert u de Teflon-afstandhouder. Met behulp van de cilindrische schroef kan het apparaat grondig worden gereinigd met water en detergent.

De verschijning van co-metabolieten van de darmmicrobiota gedurende het kolonisatieproces wordt duidelijk geïllustreerd in dit protonenspectrum van een urinair metabolisch profiel van een dier dat 20 dagen geleden is gekoloniseerd. Dit dier scheidde in de kiemvrije toestand geen indoolsulfaat en slechts zeer kleine hoeveelheden fenylacetylglycine, afgekort als PAG, en quinoline-sulfaat uit. Naarmate de kolonisatie vordert, nemen deze drie markers van eiwitmetabolisme door de darmmicrobiota aanzienlijk toe en bereiken zij op dag 20 een evenwicht.

Door de specifieke PAG-tripletpiek te integreren, was het mogelijk om de toename van deze specifieke marker over tijd te kwantificeren. Dit diagram stelt de gemiddelde PAG-concentratie voor tijdens kolonisatie voor een groep van zeven dieren; met behulp van proton H-R-M-A-S-N-M-R spectroscopie werd het hepatische metabole profiel van twee muizen voor en na kolonisatie verkregen. Deze figuur illustreert goed de informatie die kan worden afgeleid uit een op A-M-A-S-N-M-R gebaseerd metabool profiel.

Talrijke aminozuren alsmede metabolieten afkomstig uit het energetisch metabolisme kunnen worden gevisualiseerd. Deze profielen bevatten ook informatie die relevant is voor oxidatieve stress, nucleotidemetabolisme en methylamine-metabolisme. In dit voorbeeld is zeer duidelijk dat de kiemvrije muis bijna geen glycogeen en zeer lage hoeveelheden glucose en triglyceriden vertoont.

Door deze procedure te volgen, kunnen diverse statistische hulpmiddelen zoals chemometrie worden toegepast om biologische monsters te clusteren op basis van het metabole profiel en biomarkers te identificeren die geassocieerd zijn met de metabole status.