Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van SEC TED 70 s ribosoomgebonden, nascente ketencomplexen of RNC's die zijn geproduceerd tijdens translatie in een in vitro celvrij systeem. Dit wordt bereikt door eerst een SEC M-stallingsequens van 17 aminozuren lang toe te voegen aan het C-terminale uiteinde van het gen van belang en dit stroomafwaarts van de T seven transcriptionele promotor te kloneren. Vervolgens wordt het mRNA getranscribeerd middels een in vitro transcriptiereactie en daarna gezuiverd.

Vervolgens wordt het gezuiverde mRNA vertaald in een S 30 E. coli-extractsysysteem met radioactieve aminozuren om het gesynthetiseerde eiwit of het nascente polypeptide te labelen. Ten slotte worden de tweede Mr.Ed-ribosoomgebonden nascente ketencomplexen geïsoleerd door middel van sucrosegradiëntcentrifugatie en fractionering. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat nascente ketens stabiel gebonden zijn aan het 70 s-ribosoom via gelelektroforese-analyse van de gelabelde polypeptiden die uit de gradiëntfracties zijn geïsoleerd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van mRNA zonder stopcodon, is dat het met een hoge efficiëntie de binding van de nascente polypeptideketen aan het 70 s ribosoom waarborgt tijdens de translatie en de daaropvolgende centrifugatiestap. Bovendien kan deze methode, in tegenstelling tot de technologie zonder stopcodon, met vrijwel gelijke efficiëntie worden gebruikt in zowel in vitro als in vivo systemen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van translationele eivitsvouwing, zoals hoe vroeg tijdens de translatie verschillende translationele vouwingsintermediairen kunnen worden gevormd, en kan verder helpen bij het analyseren van hun structuur met behulp van directe of indirecte structuurbepaling.

Sonderings- en determinatiemethoden Deze techniek kan ons helpen het pad van eiwitvouwing op het ribosoom te ontcijferen. In dit protocol hebben we de isolatie beschreven van volledige bine gamma B kristallijne nascente ketens gebonden aan het 70 s ribosoom. Deze techniek kan echter worden gebruikt voor de isolatie van vrijwel elk eiwit van belang.

Deze strategie kan ook worden toegepast om getrunceerde nascente polypeptideketens van derm Es te isoleren. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden tijdens de stap van sucrosegradiëntcentrifugatie. Voor ervaren onderzoekers zou dit echter geen probleem moeten zijn. We hebben besloten om een tweede stalling-sequentie te gebruiken om gamma B-crystalline nascente polypeptiden gebonden aan het 70S ribosoom te isoleren, na initiële, minder succesvolle pogingen waarbij mRNA zonder stopcodon werd gebruikt.

De latere techniek kon de stabiliteit van RNC's tijdens opeenvolgende centrifugatiestappen niet met dezelfde efficiëntie waarborgen als de techniek waarbij gebruik werd gemaakt van een SECM-stopsequentie. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor de bereiding van de gradiënt en de scheiding van RNC's moeilijk te leren kunnen zijn en een zeker niveau van expertise vereisen om reproduceerbare resultaten te garanderen. De demonstratie zal worden uitgevoerd door een promovendus uit mijn laboratorium. Voer in vitro transcriptie en translatie uit. Begin met een gen van belang dat is gekloneerd in een willekeurig T7- en/of SP6-gebaseerd plasmide om ribosome nascent chain complexes of RNC's te genereren.

Verleng de C-terminus van het doelpolypeptide door de arrest-inducerende sequentie van M toe te voegen, om ervoor te zorgen dat het polypeptidefragment uit de ribosomale tunnel wordt geperst. Voeg een flexibele glycine-rijke linker toe tussen het eiwit en de SEC M-arrestsequentie ter voorbereiding op in vitro transcriptie. Gebruik een restrictie-enzym dat stroomafwaarts van het open leesraam knipt om het template-DNA te lineariseren en voer een agarosegelelektroforese uit om de volledige digestie van het monster te verifiëren. Gebruik na verificatie van de optimale DNA-concentratie een high-yield transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant om messenger-RNA te synthetiseren.

Gebruik lithiumchlorideprecipitatie om het mRNA te zuiveren. Voer vervolgens een monster uit op een acrylamide- of agarosegel om de zuiverheid te verifiëren. Voor in vitro translatie.

Voeg in een E. coli-systeem in nucleasevrij water een 1 mM aminozuurmengsel zonder methionine, 10 units ribonuclease-remmer, 20 µCi 35S-methionine, 20 µL reactiemix, 24 µL reconstitutiebuffer en 24 µL E. coli-lysaat toe. Voorwarm de reactie door deze vijf minuten te incuberen bij 30 °C. Voeg vervolgens 1 tot 2 µg mRNA toe en incubeer nogmaals 10 tot 15 minuten bij 30 °C.

Stop de reactie door deze op ijs te plaatsen om 70 S ribosoomgebonden nascente ketencomplexen of nc's te isoleren. Laag de translatiereactie op 4,5 milliliter van een 5 tot 30% sucrosegradiënt in 20 millimol HEPES, kaliumhydroxide pH 7,5, 15 millimol magnesium, 100 millimol kaliumacetaat en 1 millimol DTT. Centrifugeer 2 uur lang bij 41.000 RPM bij vier graden Celsius. Fractioneer na centrifugatie de sucrosegradiënt met behulp van een programmeerbaar dichtheidsgradiëntsysteem en een absorptiedetector ingesteld op 254 nanometer.

Verzamel de fracties die 70 s ribosomen bevatten voor verdere analyse om te bepalen of het verlengde SEC M-eiwit aan het 70 s ribosoom gebonden blijft. Precipiteer het eiwit in elke gradiëntfractie door trichloroacetic acid toe te voegen. Incubeer de monsters overnight bij vier graden Celsius; centrifugeer de monsters de volgende dag bij 14, 000 ×g gedurende 15 minuten om het eiwit te pelletteren en was de pellets in een ratio van vier op één van aceton en één millimolar tris, HCL pH 7.6.

Laat de pellets aan de lucht drogen en resuspendeer ze vervolgens in SDS-pageladbuffer. Scheid de monsters via tris-tricine SDS-page, fixeer en droog vervolgens de gels en onderwerp deze aan autoradiografie en fosfo-imaging zoals hier getoond. Na de in vitro translatie werden de 70 S ribosomen geïsoleerd via sucrosegradiëntcentrifugatie en fractionering om te garanderen dat het gamma B kristallijne eiwit stabiel gebonden blijft aan het ribosoom.

De fracties die 70 s bevatten, werden samengevoegd, ontzout, onderworpen aan bufferuitwisseling en vervolgens een extra ronde sucrosegradiëntcentrifugatie ondergaan. De hier gepresenteerde resultaten suggereren dat SEC M de translationele arrestatie van de gamma B crystallines RNC's efficiënt kan induceren. Zodra de methode onder controle is, kan deze techniek in één werkdag worden uitgevoerd, met uitzondering van de gelelektroforese-analyse van de nascent chain, die gewoonlijk een overnachtstapsgewijze TCA-precipitatie omvat.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het overduidelijk cruciaal om RNA-contaminatie in elke stap te vermijden. RNA-contaminatie kan de translationele efficiëntie van het extract beïnvloeden en leiden tot het vrijkomen van het nascente polypeptide uit het 70S-ribosoom. Door deze procedure te volgen, kan men, afhankelijk van het uiteindelijke doel, NAST en polypeptiden van een vooraf bepaalde lengte verkrijgen die stabiel gebonden zijn aan het 70S-ribosoom.

Deze complexen kunnen voor diverse doeleinden worden gebruikt, zoals het bepalen van de conformatie van ribosoomgebonden nascent chains met behulp van directe en indirecte benaderingen zoals NMR of FRET, of het testen van factor- en ligandbinding na de vorming ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de structurele biologie en eiwitvouwing om de conformatie van volledige eiwitten gebonden aan het ribosoom, alsokmaar cotranslationele vouwingsintermediairen, te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u nascent polypeptide kunt prepareren en isoleren dat stabiel gebonden is aan het 70 s ribosoom, wat vervolgens kan worden gebruikt om diverse vragen in het veld van translationele eiwitvouwing te beantwoorden.

Vergeet niet dat het werken met radioactieve isotopen en gelabelde aminozuren, zoals bijvoorbeeld 35S methionine, speciale voorzorgsmaatregelen vereist, welke altijd in acht genomen moeten worden bij het uitvoeren van deze procedure.