Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed

Het algemene doel van het volgende experiment is om het gebruik van image stream-technologie aan te tonen voor het kwantificeren van cellulaire mechanismen van primaire immuuncellen uit goed gedefinieerde patiëntcohorten. Dit wordt bereikt door eerst perifere mononucleaire bloedcellen of pbmc te isoleren uit bloedmonsters die zijn afgenomen van patiënten of gezonde vrijwilligers. Na isolatie worden de cellen geactiveerd en vervolgens fluorescent gelabeld.

Vervolgens worden de cellen hydrodynamisch gefocust, geëxciteerd met laserlicht en afgebeeld via time delay integration. CCD-camera. Ten slotte worden de beelden verkregen met de image stream cytometer en vindt kwantificatie van NF kappa b plaats.

Translocatie in elke cellulaire afbeelding wordt uitgevoerd met behulp van de ideas-software. Uiteindelijk kunnen de verschillen tussen elke proefgroep worden bepaald via analyse van dot plots, histogrammen en celafbeeldingen. Het voordeel van de imagestroom is dat het feiten en immunofluorescentie combineert.

We zijn in staat om cel-signaleringspaden op een lineage-specifieke manier te bestuderen, zowel op enkelvoudig celniveau als op populatieniveau, en dit startend met slechts een kleine bloedmonster. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale kennisvragen door signaalintermediaten te lokaliseren en te kwantificeren. Zo kan het bijvoorbeeld worden gebruikt om de door actie gemedieerde nucleaire translocatie van transcriptiefactoren te onderzoeken of om de effecten van veroudering op de celbiologie te bestuderen.

Een medewerker van mijn laboratorium demonstreert de techniek na het isoleren van perifere bloedmononucleaire cellen die zijn verkregen van menselijke vrijwilligers. Resuspendeer de teruggewonnen pBMC's op een concentratie van 3 × 10⁶ cellen per 0,6 milliliter medium en breng de celsuspensie vervolgens over in 1,5 milliliter buisjes. Stimuleer daarna een deel van de cellen met een activerend middel, zoals de hier getoonde TLR8-agonist R848, en incubeer vervolgens alle cellen gedurende 10 tot 60 minuten bij 37 °C in een incubator met 5% CO2.

Pelleteer na de incubatieperiode de cellen gedurende vijf minuten bij 500 ×g op kamertemperatuur, verwijder het supernatant en label de cellen gedurende 20 minuten bij 4 °C met een cocktail van oppervlakte-antilichamen specifiek voor monocyten- of DC-lijnen, inclusief buisjes met cellen gelabeld met enkelvoudige kleurconjugaten om als compensatiecontroles te dienen. Fixeer de cellen vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in 4% PFA-PBS. Na het centrifugeren van de cellen gedurende 10 minuten bij 500 ×g op kamertemperatuur, resuspenderen de PBMC in vriesbuffer en bewaren de cellen bij -80 °C tot ze op de dag van de assay worden geanalyseerd.

Ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37 °C en permeabiliseer ze na centrifugatie om de vriesbuffer te verwijderen met 100 µL BD perm wash buffer. Label ze vervolgens gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met antilichamen tegen intracellulaire signaalcomponenten, zoals de hier getoonde anti NF kappa BP 65-antilichamen. Na het pelleten van de cellen resuspenderen ze in 100 µL BD perm wash buffer die goat anti rabbit IgG bevat.

Alexa 6 47 en incubeer de pbmc nog 20 minuten bij kamertemperatuur. Kleur de cellen vlak voor de beeldvorming tegen met een kernkleurstof; begin met het inschakelen van de image stream en start vervolgens de inspire-software. Klik daarna op 'load default template' en selecteer vervolgens 'initialize fluidics'.

Klik vervolgens op het menu van de afbeeldingsgalerij en selecteer 'alles'. Druk nu op 'run set up' om te beginnen met het imagen van de beads en selecteer daarna het bright field-kanaal. Zodra de speed beads draaien, klikt u onder het assistentie-tabblad op 'start all' om het instrument te kalibreren en te testen.

Nadat het ImageStream-systeem is gekalibreerd, drukt u op flush, lock and load om het helderste monster in het apparaat te laden. Stel vervolgens de laserkracht zo in dat elke florachroom een maximale pixelwaarde heeft tussen 104.000 counts, zoals gemeten in de dot plots. Stel daarna de criteria voor de celclassificatie in.

Klik nu op 'run, acquire' om het experimentele databestand te verzamelen en op te slaan. Om de databestanden te analyseren, opent u eerst de analyse-software. Er worden gecompenseerde afbeeldingsbestanden gemaakt en vervolgens wordt er gegated op events met een normale nucleaire kleurstofintensiteit en een hoge nucleaire kleurstof-aspectratio. Om enkelvoudige cellen in de R1-gate te onderscheiden van debris of multicellular events, worden monocyten gevonden binnen de gate voor CD14-positieve cellen; myeloïde dendritische cellen, die hoog zijn voor CD11C en laag voor CD4 en lin1-markers, bevinden zich in de R3-gate.

Gebruik ten slotte IDEAS-software om de colocalisatie van de cytoplasmatische transcriptiefactor NF kappa B met de nucleaire kleuring te bepalen. Een hoge correlatie tussen NF kappa B en de nucleaire kleuring, wat wijst op colocalisatie van de twee markers, wordt weerspiegeld in een hoge similarity score en geeft de mate van activering van de cel aan. Het percentage events met een hoge similarity tussen verschillende behandelingsgroepen of patiëntenpopulaties kan worden vergeleken om de relatieve functionele efficiëntie van de cellen via IDEAS te evalueren.

Software kan vervolgens worden gebruikt om beelden te tonen van cellen uit belangrijke segmenten van populatiehistogrammen. ImageStream maakt het mogelijk om cel-subsets direct uit pbmc te gatten en celresponsen te beelden van gegatte, maar niet gesorteerde celpopulaties. Hier werd het effect van TLR-signalering op de nucleaire lokalisatie van NF kappa BP 65 in lin one, negatieve CD four, dim CD 11 C positieve myeloïde dcs bij de baseline gekwantificeerd.

Er werd een hoog percentage niet-gestimuleerde cellen waargenomen met de transcriptiefactor NF kappa BP 65 in het cytoplasma. Na stimulatie bleek dat de behandelde cellen een significant hogere similarity score hadden van NF Kappa BP 65 met de nucleaire kleuring PI, wat aangeeft dat NF Kappa BP 65 na stimulatie naar de nucleus is getransloceerd. Tegelijkertijd verzamelde digitale beelden van de onbehandelde en de met R 8 48 gestimuleerde celpopulaties tonen representatieve cellen en de intensiteit van de translocatie van NF kappa B naar de celkern. Let op de hogere intensiteit van de NF Kappa B- en PI-kleuring in de met R 8 48 gestimuleerde groep in vergelijking met de onbehandelde cellen.

We hebben deze techniek toegepast op cellen van donoren van verschillende leeftijden en verschillen aangetoond in de TLR-gemedieerde NF kappa B-activatiepaden. Eenmaal beheerst, kan deze techniek binnen één dag worden uitgevoerd, exclusief de extra tijd voor beeldanalyse, wat zowel diverse lokalisatiebeelden als populatiestatistieken mogelijk maakt. Bovendien kunnen we responsen direct visualiseren van meerdere celpopulaties zonder fysieke scheiding. Image stream kan breed worden toegepast op een aantal cellulaire mechanismen en zou zeer waardevol kunnen zijn in translationeel onderzoek.