Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de aard, regulatie en biologische impact van de interferon-geïnduceerde reacties in verschillende ziekteomgevingen, inclusief auto-immuniteit en infecties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de gepatenteerde gevoeligheid. Deze techniek heeft een groot potentieel voor het ontdekken van biomarkers om de patiëntenzorg bij vele ziekten te verbeteren, omdat het cytokinen kan meten met een ongekende gevoeligheid.

Een belangrijke stap met deze benadering was het neutraliseren van activiteiten die gerelateerd zijn aan patiënten met auto-immuun polyindocrien systeem type één. Om te beginnen, laad 280 miljoen paramagnetische kralen in een microfugebuis, met aantekening van het volume. Drai vervolgens de kralen kort en plaats de buis een minuut op een magnetische scheider.

Verwijder en gooi de verdunningsoplossing weg, waardoor de kralen worden geïsoleerd. Was vervolgens de kralen twee keer met BWB en twee keer met BCB. Voeg voor elke wasbeurt 200 microliter toe en vortex de buis gedurende vijf seconden.

Scheiden vervolgens de kralen van de oplossing met behulp van de magnetische scheider. Na één minuut scheiding, gooi de verdunning weg. Voeg vervolgens 190 microliter BCB per kralenvolume toe.

Vortex vervolgens kort de buis, draai de buis kort en zet de gewassen kralen op ijs. Om de kralen te activeren, combineer één milliliter koude BCB met 10 milligram EDC en vortex tot de oplossing homogeen is. Werk snel en veilig wanneer u EDC gebruikt, vanwege de inherente instabiliteit en equinus-oplossing.

Voeg vervolgens 10 microliter koude, verdunde EDC per kralenvolume toe aan de kralensuspensie en vortex de kralen kort. Plaats vervolgens de kralen op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Om antilichamen aan de kralen te koppelen, vortex en puls eerst de geactiveerde kralen.

Plaats vervolgens de kralen gedurende een minuut in een magnetische scheider en gooi de BCB-supernatant weg. Verwijder vervolgens de buis uit de magneet en was de kralen twee keer met 200 microliter BCB. Vortex vervolgens, pulseer en scheid magnetisch de kralen om de buffer te verwijderen.

Voeg vervolgens snel 200 microliter koude, buffer-uitgewisselde antilichaam toe aan de geactiveerde kralen. Na het vortexen van de kralen in oplossing, zet de suspensie op de shaker bij kamertemperatuur gedurende twee uur bij 1.000 RPM. Begin met het geven van de antilichaam-gecoate kralensuspensie een pulserende draai en gebruik vervolgens de magnetische kolom om de buffer te verwijderen.

Controleer vervolgens de concentratie van het eiwit in de buffer. Gebruik een spectrafotometer met laag volume. Op dit punt zijn de antilichamen gekoppeld aan de kralen en elke waarde boven nul betekent dat de kralen verzadigd zijn met antilichamen.

Was vervolgens de kralen met 200 microliter BWB, zoals uitgevoerd bij alle eerdere wasbeurten. Transfer vervolgens de supernatant naar een nieuwe buis en controleer de eiwitconcentratie. Kwantificering van eiwitten die van de kralen worden afgegeven, maakt de meting van antilichaamkoppeling mogelijk.

Was vervolgens de kralen opnieuw met 200 microliter BWB. Voeg vervolgens 200 microliter bead-blocking buffer toe, vortex de buis gedurende vijf seconden en breng deze over naar de shaker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Na 30 minuten worden de kralen geblokkeerd.

Was ze vervolgens één keer met 200 microliter BWB, gevolgd door twee keer wassen met 200 microliter bead diluent buffer voor elke wasbeurt. Bewaar vervolgens de gecoate en geblokkeerde kralen in 200 microliter bead diluent buffer bij vier graden Celsius. Dit gedeelte van de video suggereert strategieën voor het aanpassen van de testomstandigheden met behulp van de single molecule array analyzer software in de eigen bierconfiguratie.

Begin met het testen van verschillende combinaties van gecoate antilichaamkralen en biotinyleringsdetectieantilichaam in beide antilichaamcombinaties. Test vervolgens combinaties van de drie verschillende gecoate antilichaamconcentraties met twee verschillende biotinyleringsverhoudingen voor detectie- en gecoate antilichamen en vice versa. Kies vervolgens de combinatie die het laagste detectieniveau biedt en gebruik deze voor verdere stappen.

In dit geval geeft een verhouding van 30 op één biotin tot antilichaam het beste detectielimiet. Vergelijk vervolgens een twee-stappen configuratie met een drie-stappen configuratie. Drie-stappen configuraties hebben drie verschillende incubatiestappen.

Een met het gecoate antilichaam, een met het detectieantilichaam en een laatste, derde voor de SBG-enzymlabeling. Twee-stappen configuraties combineren de gecoate en detectie-incubaties. Voer de single-molecule array analyzer uit met behulp van de geselecteerde gecoate en detector antilichaamconcentraties en verhoudingen in de twee- en drie-stappen configuraties, vooraf geconfigureerd in de analyzer, volgens de instructies van de fabrikant.

Kies vervolgens de configuratie die de hoogste gevoeligheid mogelijk maakt en bewaar deze voor toekomstige stappen. In dit geval geeft de twee-stappen configuratie op elk testpunt iets hogere gevoeligheid. Optimaliseer vervolgens de concentraties van het detectorantilichaam en de SBG.

Test drie verschillende concentraties detectorantilichaam met drie verschillende concentraties SBG. Kies de concentraties die de hoogste gevoeligheid geven en bewaar ze voor toekomstige stappen. In dit geval hebben 0,3 microgram per milliliter antilichaam en 150 pica molaire SBG het optimale detectieniveau met lage achtergrondniveaus met gelukkige medium amplitude.

Voor aanvullende optimalisatie stappen, raadpleeg het tekstprotocol. Daarin staan procedures voor het optimaliseren van testspecificiteit en reproduceerbaarheid en een test voor eiwitconcurrentie. Met behulp van een test die is geoptimaliseerd om 13 subklassen van interferon-alpha te detecteren, werden plasma en serum geanalyseerd bij SLE-patiënten, JDM-patiënten en gezonde controles.

Hoge niveaus van interferon-alpha-eiwit werden gedetecteerd in beide ziektecohorten. De stippellijn geeft het detectieniveau aan van een conventionele, commercieel verkrijgbare Eliza die het interferon-alpha-eiwit niet zou detecteren in deze